Aktive Graphen-Sensor-Arrays

Aktive Graphen-Sensor-Arrays

Graphen-Sensor-ArraysAktive Graphen-Sensor-Arrays für die langfristige und drahtlose Kartierung der epikortikalen Hirnaktivität in einem breiten Frequenzband

Zusammenfassung

Graphen-Sensor-Arrays – Aktive Graphen-Sensoren haben vielversprechende Fähigkeiten für die Erfassung elektrophysiologischer Signale im Gehirn gezeigt. Ihre funktionellen Eigenschaften in Verbindung mit ihrer Flexibilität sowie ihrer erwarteten Stabilität und Biokompatibilität haben sie zu einem vielversprechenden Baustein für groß angelegte sensorische neuronale Schnittstellen gemacht. Um jedoch zuverlässige Werkzeuge für neurowissenschaftliche und biomedizintechnische Anwendungen bereitzustellen, muss der Reifegrad dieser Technologie gründlich untersucht werden. Hier bewerten wir die Leistung von 64-Kanal-Graphen-Sensor-Arrays in Bezug auf Homogenität, Empfindlichkeit und Stabilität unter Verwendung einer drahtlosen, quasi kommerziellen Kopfbühne und demonstrieren die Biokompatibilität von epikortikalen chronischen Graphen-Implantaten. Zur Veranschaulichung des Potenzials der Technologie zur Erfassung kortikaler Signale von infra-langsamen bis hin zu hohen Gamma-Frequenzbändern führen wir darüber hinaus eine kabellose Langzeitaufzeichnung in einem sich frei verhaltenden Nagetier durch, die als Proof-of-Concept gilt. Unsere Arbeit zeigt die Reife der Graphen-basierten Technologie, die ein vielversprechender Kandidat für chronische, breitbandige neuronale Sensorschnittstellen ist.

Einleitung

Die Erhöhung der Bandbreite neuroelektronischer Schnittstellen in Bezug auf die räumliche Auflösung und die Empfindlichkeit in einem breiten Frequenzbereich ist eine große und andauernde Herausforderung in der Neuraltechnik. In den letzten Jahrzehnten wurden große Anstrengungen unternommen, um neuronale Sensorschnittstellen mit hoher Sensoranzahl auf konformen Substraten zu entwickeln, die für hochgradig biokompatible intrakranielle neuronale Sonden erforderlich sind. In diesem Zusammenhang haben sich aktive Sensoren als vielversprechender Baustein für neuronale Schnittstellen mit hoher Bandbreite erwiesen, da sie in einem Multiplex-Array angeordnet werden können, was Sonden mit hoher Sensorenzahl ermöglicht. Das Detektionsprinzip aktiver Sensoren basiert in der Regel auf der Modulation der Leitfähigkeit eines Transistorkanals, der über sein Gate elektrisch mit der biologischen Umgebung gekoppelt ist, wodurch eine lokale Signalvorverstärkung erzeugt wird. Obwohl aktive Sensortechnologien erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Mikroelektroden-Arrays bieten, ist ihre Umsetzung derzeit durch die erforderlichen anspruchsvollen Materialeigenschaften begrenzt. Um langfristige und hochempfindliche neuronale Aufzeichnungen zu ermöglichen, müssen die Materialien für aktive Sensoren halbleitende oder halbmetallische Eigenschaften, eine hohe elektrische Mobilität und ein geringes Eigenrauschen aufweisen, außerdem eine hohe Stabilität, eine einfache Integration in flexible Substrate und Biokompatibilität. Einige aktive Sensoren auf der Grundlage von organischen Halbleitern und dünnen Si-Nanomembranen haben vielversprechende Leistungen gezeigt, wobei neuartige Transistorarchitekturen und isolierende Technologien ihre Leistung in einigen typischerweise eingeschränkten Aspekten wie ihrem Frequenzgang oder ihrer Langzeitstabilität verbessern. Aktive Sensoren auf Graphenbasis sind ein weiterer vielversprechender Kandidat, um diese Anforderungen zu erfüllen, und zwar aufgrund der Flexibilität von Graphen, seiner erwarteten hohen Stabilität und Biokompatibilität sowie seiner elektronischen Eigenschaften, einschließlich der hohen Mobilität der Ladungsträger. Graphen-Feldeffekttransistoren mit Lösungseingang (g-SGFETs) haben eine hohe Empfindlichkeit für den Nachweis lokaler Feldpotentiale (LFP) sowie eine hohe Leistung im Multiplexbetrieb gezeigt. Darüber hinaus haben g-SGFETs vor kurzem eine hohe Empfindlichkeit für die Kartierung von infra-langsamer (<0,5 Hz) Hirnaktivität (ISA) mit hoher räumlicher Auflösung gezeigt.

BrotbackautomatISA hat in letzter Zeit aufgrund ihrer einzigartigen neurophysiologischen Grundlage und ihrer Beziehung zu Ruhezustandsnetzwerken und zu Hirnzuständen zunehmende Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Bislang wurde die ISA in der Regel mit Hilfe der Vollband-Elektroenzephalographie (fb-EEG) untersucht. Die Erhöhung der räumlichen Auflösung der ISA-Überwachung durch die Verwendung kleinerer Elektroden ist jedoch letztlich durch die Abhängigkeit der Verstärkung von der Impedanz der verwendeten Elektroden begrenzt. Diese Abhängigkeit führt zu Signal-Rausch-Verlusten und Signalverzerrungen bei niedrigen Frequenzen. Aus diesem Grund beschränken sich Untersuchungen der ISA mit hoher räumlicher Auflösung in der Regel auf indirekte Messmethoden wie die funktionelle Magnetresonanztomographie, optische Methoden oder die Analyse von infra-langsamen Änderungen der Signalleistung bei höheren Frequenzen. G-SGFETs wandeln als aktive Sensoren die elektrochemischen Potenzialsignale im Gehirn (Vsig) in Drain-Source-Stromsignale (Ids) um (siehe Abb. 1a). Die Amplitude der umgewandelten Signale ist proportional zur Transkonduktanz (gm), definiert als die Steigung der Ids-Vgs-Kurven geteilt durch Vds (siehe Abb. 1b). gm ist proportional zur Gate-Kapazität pro Flächeneinheit (intensive Eigenschaft) und zum W/L-Verhältnis des Transistors, aber nicht zu seiner aktiven Fläche. Die auf dem Feldeffekt-Mechanismus basierende Signaldetektion ermöglicht es daher, die Signalverzerrung und den Verstärkungsverlust zu vermeiden, die bei kleinen passiven Sensoren im Infraschall-Frequenzband beobachtet werden. Dieser Vorteil dürfte für alle FET-basierten Sensortechnologien mit stabilen Übertragungscharakteristiken gelten, jedoch wurde der experimentelle Nachweis nur für g-SGFETs erbracht, die eine besonders hohe chemische Inertheit aufweisen. Die Eigenschaften von g-SGFETs stellen eine qualitative Veränderung bei der Untersuchung von ISA dar und ermöglichen die Erforschung ihrer physiologischen Rolle mit einer verbesserten räumlichen Auflösung. Um bei der tatsächlichen Anwendung von g-SGFET-Arrays voranzukommen, müssen jedoch noch mehrere technische Aspekte gründlich bewertet werden.

 

Bild 1a Schematische Darstellung eines g-SGFET und seines Ersatzschaltbildes. Die Kleinsignaltransduktion von Spannung zu Strom wird durch die Stromquelle GmVsig modelliert, wobei Gm ≡ dIds/dVgs. Der Gleichstrom wird durch das Element Rds modelliert. b Durchschnittliche stationäre Übertragungseigenschaften von 8 g-SGFETs (linke Achse) und gm von 64 g-SGFETs (rechte Achse). Die gefüllte Fläche gibt die Standardabweichung an. c Abbildung der Ratte mit dem implantierten ungefesselten Aufzeichnungssystem. Die Kopfbühne und der 3D-gedruckte Rahmen, der sie hält, sind von einem 3D-gedruckten Gehäuse bedeckt. Oben sind die Positionsmarker des Bewegungserfassungssystems (Mocap) befestigt, die das Licht zu den im Raum platzierten Mocap-Kameras zurückreflektieren. Die von den Graphen-Sensoren übertragenen neuronalen Signale werden digitalisiert und drahtlos an den Signalempfänger übertragen, der zur Signalaufzeichnung an einen Computer angeschlossen ist. d g-SGFET-Array auf dem Rattenkortex; die Position der Referenzelektrode in Kontakt mit dem Kleinhirn und zwei Pt-Ir-Elektroden an beiden Seiten des g-SGFET-Arrays sind mit Pfeilen markiert. e Foto der kabellosen Kopfbühne, die für diese Experimente entwickelt wurde. f Foto des 64 g-SGFET-Arrays, das auf einem speziell angefertigten Stecker montiert ist (links), und gezoomtes Bild des aktiven Bereichs der Sonde (rechts). Die roten Quadrate zeigen die g-SGFETs auf dem Array an, die mit den Eingängen der Kopfbühne mit Gleichstromfunktion verbunden sind.

In diesem Artikel stellen wir ein Sensorsystem vor, das aus einem flexiblen 64-Kanal-g-SGFET-Array und einer kabellosen Kopfbühne besteht (Abb. 1c-f und ergänzende Informationen S1), mit dem wir die Reife dieser Technologie in Bezug auf langfristige und breitbandige Aufzeichnungsmöglichkeiten bei sich frei bewegenden Tieren aus einer Systemperspektive demonstrieren. Zunächst liegt der Schwerpunkt auf der Bewertung der In-vitro-Eigenschaften des Systems, einschließlich der Ausbeute und Homogenität der Graphen-Sensoren, ihres Eigenrauschens und der Auswirkungen des Datenerfassungssystems (DAQ) auf die Empfindlichkeit dieser Geräte. Zweitens wurden kritische Aspekte für die chronische Anwendung in vivo geklärt, einschließlich der Stabilität der Graphen-Dotierung, der Langzeitstabilität der Empfindlichkeit der g-SGFETs und ihrer akuten und chronischen Biokompatibilität. Schließlich haben wir diese Methodik angewandt, um die epikortikalen lokalen Feldpotentiale (LFP) in einem sich frei bewegenden Rattenmodell gleichzeitig mit seiner dreidimensionalen (3D)-Position während langer Sitzungen von bis zu ∼24 h zu überwachen. Die Kombination von Verhaltens- und elektrophysiologischen Daten wurde verwendet, um die Fähigkeiten des drahtlosen Aufzeichnungssystems zur Überwachung der Hirndynamik bei ungestörtem Wechsel der Hirnzustände zu bewerten und seine Empfindlichkeit bei der Erkennung von hochfrequenten Oszillationen in Verbindung mit spärlichen Verhaltensereignissen zu validieren. Zur Veranschaulichung der einzigartigen Eigenschaften der g-SGFET-Aufzeichnung zeigen wir in einem ersten Fall ein infra-langsames topographisch spezifisches und hirnzustandsinvariantes Muster, das mit Hochspannungsspindeln (HVS) verbunden ist. Darüber hinaus finden wir Veränderungen in der Leistung des infra-slow-Signals zwischen Slow-Wave-Schlaf (SWS) und Rapid-Eye-Movement-Schlaf (REM) und identifizieren die Modulation von Theta-Oszillationen und Schlafspindeln durch die Phase der DC-Signal-Infra-slow-Dynamik während REM bzw. SWS. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass neuronale Sonden auf der Grundlage aktiver Graphen-Sensor-Arrays eine ausgereifte Technologie mit hoher Empfindlichkeit, Stabilität und Biokompatibilität darstellen, die es ermöglicht, die epikortikale Hirndynamik in breiten Frequenzbändern bei frei lebenden Tieren chronisch zu erfassen.

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Ergebnisse

Homogenität und Empfindlichkeit der aktiven Graphen-Sensortechnologie

Für die Implementierung von aktiven Graphen-Sensor-Arrays als leicht verfügbares Werkzeug für die neurowissenschaftliche Forschung ist die Reife der großflächigen, flexiblen Graphen-Elektronik entscheidend. Zwei der größten Herausforderungen bei der Entwicklung dieser Technologien waren bisher die Herstellung von hochwertigem einlagigem Graphen (SLG) und dessen Übertragung auf das erforderliche Substrat. Die Entwicklung von Methoden zur Herstellung von SLG im Wafer-Maßstab hat in den letzten zehn Jahren viele Anstrengungen und Investitionen in Anspruch genommen und kürzlich zu wichtigen Fortschritten beim Wachstum von Graphen durch chemische Gasphasenabscheidung (CVD) geführt. Hier zeigen wir, dass die Qualität von handelsüblichem einlagigem Graphen, das durch CVD hergestellt und auf ein flexibles Polymersubstrat (das auf einen 4-Zoll-Si-Wafer geschleudert wurde) übertragen wurde, hoch genug ist, um die Herstellung von g-SGFET-Arrays mit einer homogenen guten Leistung sowohl in Bezug auf gm als auch auf elektrisches Rauschen bei niedrigen Frequenzen zu ermöglichen.

Abbildung 2a zeigt den Boxplot für die gm von neun neuronalen Sonden, die jeweils 64 g-SGFETs enthalten (mit einer Größe von 100 × 100 μm2, die für die mesoskalige epikortikale LFP-Analyse ausgewählt wurde). Diese Sonden wurden nach dem Zufallsprinzip aus drei Wafern ausgewählt, die alle in unabhängigen Chargen verarbeitet wurden (siehe „Methoden“ für Einzelheiten zur Herstellung). Es ist eine hohe Homogenität und Ausbeute in Bezug auf das gm zu beobachten, wobei 99 % der Kanäle funktionieren (definiert als Transistoren mit einem gm über dem 0,7-fachen des Medians). Der gemessene Medianwert von gm, 1,9 mS/V, ist relativ hoch im Vergleich zu flexiblen Silizium-FETs8 und vergleichbar mit typischen Werten für organische Transistoren aufgrund der hohen elektrischen Mobilität und Gate-Kapazität von g-SGFETs. In Abb. 2b ist das äquivalente Rauschen am Gate (Vgs-rms) der gleichen Bauelemente dargestellt (siehe Zusatzinformation S2). Vgs-rms ist eine wichtige Kennzahl zur Bewertung der Empfindlichkeit der Sensoren, die als Verhältnis zwischen dem integrierten Stromrauschen (Ids-rms) des Transistors und seiner Transkonduktanz definiert ist. Obwohl dieser Parameter eine größere Streuung als gm aufweist, ist es möglich, 3 von 9 Sonden zu identifizieren, wobei 96 % der g-SGFETs eine Vgs-rms unter 10 µVrms aufweisen, was darauf hindeutet, dass das gemessene Rauschen nicht direkt mit gm zusammenhängt. Tatsächlich wurde berichtet, dass niederfrequentes Rauschen in Graphen von „charge trapping-detrapping“-Ereignissen herrührt, wodurch das Rauschen direkt proportional zur Dichte der Fallen ist und somit empfindlich auf Verunreinigungen in der Graphenumgebung reagiert. Die Abbildungen 2c und d zeigen die Verteilung von gm bzw. Vgs-rms für die Sonde #3, die in Abb. 2a mit einem Sternchen gekennzeichnet ist. Die Streuung in der Transkonduktanz der g-SGFETs kann bei der Kalibrierung der neuronalen Signale berücksichtigt werden, indem die Streuung in der Signalverstärkung korrigiert wird. Der wirklich begrenzende Faktor in Bezug auf die Homogenität der Leistung der g-SGFETs ist daher das äquivalente Rauschen am Gate. Vgs-rms weist eine lognormale Verteilung mit einem Mittelwert von 4,13 μVrms und einer Standardabweichung von 1,14 μVrms auf (ohne die in Abb. 2b gezeigten Ausreißer). Diese Ergebnisse zeigen, dass neuronale Sonden auf Graphenbasis, die mit einem 4-Zoll-Wafer-Fertigungsverfahren hergestellt werden, eine hohe Homogenität und Empfindlichkeit aufweisen. Darüber hinaus wird erwartet, dass eine Skalierung des Herstellungsprozesses auf einen industriellen Maßstab die Homogenität der Eigenschaften von g-SGFETs weiter verbessern wird, insbesondere im Hinblick auf das kontaminationsabhängige Ladungsrauschen.

Bild 2a Boxplot von gm für neun zufällig ausgewählte Sonden aus drei verschiedenen Wafern, die in unabhängigen Chargen hergestellt wurden. Die Ausbeute in Form von gm über 70 % des Medians ist angegeben. b Boxplot für Vgs-rms, gemessen im Frequenzbereich von 1-10 Hz, aufgetragen für dieselben neuronalen Sonden, die in Teil a bewertet wurden. Alle Sonden bestehen aus 64 g-SGFETs. Die Kästchen reichen vom unteren bis zum oberen Quartil, mit einer Linie beim Median. Die Whisker erstrecken sich über das 1,5-fache des Interquartilsbereichs, und die Datenpunkte außerhalb der Whisker sind durch einen Punkt gekennzeichnet. c Histogramm von gm für die 64 g-SGFETs der Sonde Nr. 3 (beschriftet in Feld a) und Gauß-Fit des Histogramms ohne die in Feld a gezeigten Ausreißer. d Histogramm von Vgs-rms für die 64 Transistoren in Sonde Nr. 3 (siehe Feld b) und lognormale Anpassung des Histogramms unter Ausschluss der in Feld b gezeigten Ausreißer. e Ersatzschaltung der drahtlosen Kopfbühne. f Leistungsspektraldichte (PSD) des Rauschens von DC-Kanälen (schwarz) und AC-Kanälen (orange) in Sonde Nr. 3. Die 1/f-Abhängigkeit wird durch die durchgezogene rote Linie dargestellt. Die vertikale orangefarbene Linie zeigt den Hardware-Hochpassfilter an, der auf die AC-Kanäle bei 0,15 Hz angewendet wird. Das Quantisierungsrauschen der DC- und AC-Kanäle wird durch die horizontalen gestrichelten roten Linien dargestellt. g Darstellung der Vgs-rms für alle g-SGFETs in Sonde Nr. 3 für verschiedene Bandbreiten: 0,05-0,5 Hz-Band für die DC-Kanäle (links), 1-10 Hz-Band (Mitte) und 20-200 Hz (rechts). Die Position der g-SGFETs auf dem Array, die mit den DC-Kanälen der Kopfbühne verbunden sind, ist durch die roten Quadrate gekennzeichnet. h Zeitbereichsdarstellung der in Teil f und g gezeigten Rauschspektren (DC-Kanäle gefiltert im Band 0,05-0,5 Hz und AC-Kanäle im Band 20-200 Hz). Die Signale von acht Kanälen sind überlagert.

Design und Eigenschaften der drahtlosen Hauptbühne

Ein weiterer Aspekt, der zur Empfindlichkeit des Aufzeichnungssystems beiträgt, ist das Rauschen, das durch die Kopfbühne in den Verstärkungs- und Digitalisierungsprozess eingebracht wird. Die Verstärkung der Aktivität in einem breiten Frequenzband erfordert ein gleichstromgekoppeltes System, was die Digitalisierung von Signalen mit großen Gleichstromabweichungen voraussetzt. Um Signale mit einem so großen Dynamikbereich zu digitalisieren und das Quantisierungsrauschen zu minimieren, wurde ein zweistufiger Transimpedanzverstärker implementiert (siehe Schaltplan in Abb. 2e). Die erste Stufe wandelt die Ids-Ströme aus den g-SGFETs in eine Spannung um, die ein Signal mit einem breiten Frequenzband enthält, einschließlich der infra-langsamen Frequenzkomponenten von Ids. In der zweiten Verstärkungsstufe (siehe Abb. 2e) wird das Signal durch einen Hochpass gefiltert, um den DC-Offset zu entfernen und die volle Skala des Analog-Digital-Wandlers (ADC) zu füllen. Um dynamisch zwischen einer DC- oder AC-Kopplung für jeden Kanal wählen zu können, wurde ein Multiplexer hinzugefügt, der zwischen dem Ausgang der ersten und der zweiten Stufe umschaltet (siehe Abb. 2e). Multiplexer wurden nur in 8 der 64 Kanäle implementiert, um den Stromverbrauch und damit auch das Gewicht und das Volumen der Batterie der drahtlosen Kopfbühne zu minimieren.

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Eine relativ hohe Transkonduktanz ist wichtig, um die Signale oberhalb der Rauschgrenze der Transimpedanzverstärker vorverstärken zu können. Aktive Sensoren weisen jedoch in der Regel ein intrinsisches 1/f-Rauschen auf, das mit dem Drain-Source-Strom skaliert. Daher ist Vgs-rms eine geeignetere Kennzahl für die Bewertung der Empfindlichkeit aktiver Sensoren. Um zu bestätigen, dass die Empfindlichkeit des Aufzeichnungssystems durch das Eigenrauschen der aktiven Sensoren begrenzt wird, ist es von entscheidender Bedeutung, die Auswirkungen der Verstärkungselektronik auf die Empfindlichkeit des Systems in einem breiten Frequenzband zu bewerten. Der Rauschpegel für Gleich- und Wechselstromkanäle kann anhand der spektralen Leistungsdichte (PSD) des äquivalenten Spannungsrauschens am Gate (SVgs(f)), definiert als PSD des Stromrauschens über der Transkonduktanz, bewertet werden (siehe Abb. 2f). Der zentrale Teil des Spektrums, von etwa 0,05 Hz bis 10 Hz, wird durch das 1/f-Eigenrauschen der Graphen-Transistoren dominiert. Bei Frequenzen unter 0,05 Hz zeigen die DC-Kanäle einen leichten Anstieg über das 1/f-Rauschen hinaus, was auf den Beitrag zusätzlicher Rauschquellen in der Verstärkungskette zurückzuführen ist und zu etwas größeren Vgs-rms-Werten im Bereich von 0,005-0,05 Hz führt (siehe Zusatzinformation S2). Oberhalb von 10 Hz weisen die Rauschspektren einen signifikanten Anstieg über das 1/f-Rauschen auf, das durch das Quantisierungsrauschen der Kopfbühnenverstärker verursacht wird und in den DC-Kanälen stärker ausgeprägt ist. Die in verschiedenen Frequenzbändern integrierten SVgs(f) sind in Abb. 2g für alle Kanäle der neuronalen Sonde #3 dargestellt. Die drei Karten zeigen, dass die Empfindlichkeit des Systems in den verschiedenen Bereichen ähnlich ist, wobei nur im Bereich von 20-200 Hz ein deutlicher Anstieg zu verzeichnen ist. In diesem Bereich übersteigt das Rauschen der DC-Kanäle das Rauschen der AC-Kanäle; allerdings halten alle Graphen-Sensoren (mit Ausnahme eines Ausreißers) Vgs-rms-Werte unter 15 µV. Das Digitalisierungsrauschen für AC-Kanäle könnte durch weitere Optimierung der Verstärkung der zweiten Verstärkungsstufe verringert werden. Es ist jedoch zu erwarten, dass das Eigenrauschen des Verstärkers bei großen Verstärkungswerten dominiert. Um die konstante Empfindlichkeit über die Frequenz besser zu veranschaulichen, zeigt Abb. 2h die Zeitbereichsdarstellung des im ISA-Band (0,05-0,5 Hz) und im Hochfrequenzband (20-200 Hz) gefilterten Rauschsignals. Das Histogramm, das neben der Zeitbereichsdarstellung beider Signale aufgetragen ist, zeigt deren Wahrscheinlichkeitsdichteverteilung, was die Ähnlichkeit ihrer Varianz verdeutlicht, wie sie durch die Integration eines 1/f-Spektrums in diesen Frequenzbändern zu erwarten ist. Man beachte, dass die scheinbar geringere Amplitude in der Zeitbereichsdarstellung des Infraschallrauschens auf die unterschiedlichen Zeitskalen des 1/f-Rauschens in beiden Frequenzbändern zurückzuführen ist, nicht aber auf eine unterschiedliche Signalvarianz.

Diese Ergebnisse zeigen die hohe Empfindlichkeit des Systems in einem breiten Frequenzband, mit Vgs-rms unter 5 μV im infra-slow Frequenzband. Beim Entwurf der Kopfbühne haben wir den Kompromiss zwischen dem Erreichen maximaler Empfindlichkeit im Hochfrequenzbereich und der Minimierung des Stromverbrauchs des DC-gekoppelten Aufzeichnungssystems mit einer relativ hohen Kanalzahl berücksichtigt. Es wird erwartet, dass kleinere g-SGFETs ein höheres Eigenrauschen aufweisen (siehe Zusatzinformation S2), wie es für jeden aktiven oder passiven Sensor zu erwarten ist. Daher deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Empfindlichkeit von g-SGFETs im Infraschallbereich bei Sensorflächen unter 100 × 100 μm nicht durch die Verstärkungselektronik beeinträchtigt wird. Dies steht in starkem Gegensatz zur ISA-Detektion mit passiven Elektroden, bei der der Verstärkungsverlust und die Signalverzerrung bei kleineren Sensorabmessungen voraussichtlich zunehmen werden. Diese Ergebnisse zeigen die Grenzen und die Skalierbarkeit der g-SGFET-Technologie im Hinblick auf Arrays mit höherer Dichte und ISA-Detektionsmöglichkeiten.

Amino opti-8 Presslinge - veganSignalstabilität und Empfindlichkeit im Zeitverlauf

Sobald die Leistung der Graphen-Transistoren und der Kopfbühne ordnungsgemäß bewertet wurde, muss die Stabilität der g-SGFETs in einer chronischen In-vivo-Umgebung bewertet werden, um die Zuverlässigkeit des Aufzeichnungssystems zu gewährleisten.

Die Ids-Vgs-Kurven der g-SGFETs beschreiben die Beziehung zwischen dem gemessenen Drain-Source-Strom und dem elektrochemischen Potenzial an der Graphen-Elektrolyt-Grenzfläche. Das Ids-Minimum tritt bei einer bestimmten Gatespannung auf, dem so genannten Ladungsneutralitätspunkt (CNP), der auch mit einem Minimum der Empfindlichkeit des Bauelements verbunden ist (siehe Abb. 1a). Der CNP entspricht den Vorspannungsbedingungen, bei denen die Fermi-Energie im Graphenkanal im Durchschnitt am nächsten an der Energie mit einer minimalen Zustandsdichte (d. h. dem Dirac-Punkt) lieg. Das zum Erreichen dieser Energie erforderliche Vgs-Überpotenzial hängt von der Dotierung des Graphenkanals sowie vom elektrochemischen Potenzial der Referenzelektrode ab. Daher führen Instabilitäten bei einem dieser beiden Parameter zu einer Verschiebung der Übertragungseigenschaften in der Vgs-Achse. Diese Verschiebung bedeutet wiederum, dass Ids eine Drift aufweist und dass die Empfindlichkeit der g-SGFETs bei konstantem Vgs-Überpotenzial im Laufe der Zeit variieren kann. Eine kontrollierbare Dotierung der g-SGFETs und ein homogenes CNP unter den Sensoren ist daher von größter Bedeutung, um eine gute Empfindlichkeit des Sensorarrays zu erhalten.

Abbildung 3a zeigt die Entwicklung der Übertragungseigenschaften über 4 Wochen nach der Implantation der neuronalen Sonde (Einzelheiten zur Implantation siehe „Methoden“). Die beobachtete Verschiebung des CNP ist vermutlich auf eine Kombination von Faktoren zurückzuführen, darunter die Desorption von Verunreinigungen durch elektrochemische Reinigung der Graphen-Elektrolyt-Grenzfläche, die Adsorption geladener chemischer Spezies in der Umgebung oder Änderungen des Referenzelektrodenpotenzials (siehe ergänzende Informationen S3). Anhand dieser Ergebnisse ist es jedoch nicht möglich, zwischen allen verschiedenen Beiträgen zu unterscheiden. Die kumulierte Drift im CNP, die während der ersten 24 Stunden der Aufzeichnung gemessen wurde, erreicht etwa 50 mV, mit einer maximalen Änderungsrate von ∼20 mV/h in der ersten Stunde (siehe ergänzende Information S3). Abbildung 3b zeigt das gemessene Signal in zwei DC-gekoppelten Kanälen (hochpassgefiltert bei 1 mHz) während der ersten 2 Stunden der Aufzeichnung. Abbildung 3c zeigt die Amplituden-Phasen-Beziehung zwischen diesen beiden DC-gekoppelten Kanälen im Bereich von 0,005-0,05 Hz (siehe Abschnitt „Methoden“). Das linke Feld zeigt die in PBS gemessene Amplituden-Phasen-Kopplung, während das rechte Feld die entsprechenden Ergebnisse in vivo zeigt. Die In-vivo-Signale weisen Fluktuationen mit einer viel größeren Amplitude auf als die in PBS aufgezeichneten Signale, so dass das 1/f-Rauschen des Transistors und das Kopfbühnenrauschen als Ursache für diese infra-langsamen Oszillationen ausgeschlossen werden können. Darüber hinaus weisen die in vivo aufgezeichneten Signale im Bereich von 0,005-0,05 Hz gegenphasige Fluktuationen auf, was bestätigt, dass weder Instabilitäten in der Referenzelektrode noch die Adsorption/Desorption chemischer Spezies auf Graphen für diese Fluktuationen verantwortlich sind. Zum Abschluss dieser Diskussion zeigt Abb. 3d die Auswirkungen von Abweichungen bei der Graphen-Dotierung auf die Vgs-rms von Graphen-Sensoren. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich ihre Empfindlichkeit aufgrund der akkumulierten Drifts bis zu 24 Stunden lang nicht wesentlich ändert, wenn die anfängliche Vorspannung richtig gewählt wird. Daher reicht es aus, den CNP täglich zu verfolgen und das Vgs-Überpotenzial wieder auf optimale Werte einzustellen, um eine konstante Empfindlichkeit bei der langfristigen Überwachung der Gehirndynamik zu erhalten.

Bild 3a CNP gegen die Zeit über 4 Wochen. Die Einfügung zeigt die Ids-Vgs-Kurven. Mittelwert und Standardabweichung für n = 8 g-SGFETs (1 Ausreißer ausgeschlossen). b Signal von zwei DC-gekoppelten Kanälen. Angezeigte Positionen entsprechen der Karte in Tafel h. Das Spektrogramm des Kanals (5,7) ist dargestellt (unten). c Die Phasen-Amplituden-Beziehung zwischen den Kanälen in Tafel b, für das im Becherglas gemessene Rauschen (links) und für die in vivo gemessenen Signale (rechts). d Boxplot von Vgs-rms vs. Verschiebungen im effektiven Gating (Vgs-VCNP) der 64 g-SGFETs. Der farbige Bereich zeigt die gemessene Drift des CNP bezogen auf eine Ag/AgCl-Elektrode während der ersten 24 Stunden der Aufzeichnung. Die anfängliche Vorspannung und das CNP sind durch die roten bzw. grünen vertikalen Linien gekennzeichnet. e gm (oben) und Vgs-rms (unten) gemessen über 4 Wochen nach der Implantation; gm wurde aus den Ids-Vgs-Kurven der DC-gekoppelten Kanäle gewonnen (n = 8 g-SGFETs, 1 Ausreißer ausgeschlossen). f Stromrauschen über 4 Wochen nach der Implantation (n = 64 g-SGFETs). Die numerischen Werte geben die Ausbeute an funktionierenden Geräten an (siehe Zusatzinformation S4). Die Kästen in den Feldern a und d-f erstrecken sich vom unteren bis zum oberen Quartil, mit einer Linie beim Median. Die Whisker erstrecken sich über das 1,5-fache des Interquartilsbereichs, und die Datenpunkte außerhalb der Whisker sind durch einen Punkt gekennzeichnet. g Mittelwert und Standardabweichung der frequenzabhängigen Transkonduktanz (|gm | (f)), dargestellt für verschiedene Tage nach der Implantation (n = 10 g-SGFETs). Der Einschub zeigt die ungefähre Position der Pt-Ir-Elektrode in der Nähe des Arrays, die simulierten Äquipotentialkonturlinien in einer leitenden Ebene und die relative Signalamplitude, die von jedem der g-SGFETs im Array gemessen wurde (siehe Zusatzinformation S5). h Signale, die von allen g-SGFETs im Array während eines Zustands erhöhter Theta-Aktivität an Tag 1 und Tag 6 nach der Implantation gemessen wurden.

Zusätzlich zu den Veränderungen bei der Dotierung von Graphen können sich die Transkonduktanz und das Rauschen der g-SGFETs im Laufe der Zeit ändern, beispielsweise durch die Entstehung von Defekten im Graphengitter. Unverfälschtes Graphen weist aufgrund seiner sp2-Hybridisierung eine ausgezeichnete chemische Stabilität auf. Allerdings erhöhen baumelnde Bindungen an Kanten, Korngrenzen, atomare Leerstellen oder Umstrukturierungen im Atomgitter die Reaktivität von Graphen, was im Laufe der Zeit zur Bildung von Defekten führen kann. Darüber hinaus könnte es mechanische Ursachen für eine Leistungsverschlechterung geben, z. B. die Ablösung von Graphen vom Substrat oder eine durch Biegung verursachte Belastung des Graphengitters und der Metall-Graphen-Kontakte. Eine weitere mögliche Ursache für die Verschlechterung der Empfindlichkeit könnte die Einkapselung des Bauelements durch Glia-Narbengewebe sein. Diese Gewebeschicht kann als elektrische Impedanz in Reihe mit der Graphen-Elektrolyt-Grenzfläche modelliert werden, was letztendlich zu einem verschlechterten Frequenzgang der g-SGFETs führen kann.

Um Veränderungen der Empfindlichkeit im Laufe der Zeit in einem chronischen Implantat zu verfolgen, wurden der aus den Ids-Vgs-Kurven extrahierte gm-Wert und der Vgs-rms-Wert für die 8 DC-gekoppelten Kanäle über 4 Wochen regelmäßig gemessen. Abbildung 3e zeigt, dass gm annähernd konstant blieb, was darauf hindeutet, dass keine größeren Defekte im Graphenkanal in der In-vivo-Umgebung entstehen. In ähnlicher Weise zeigt der Vgs-rms-Wert in den letzten Tagen nur einen leichten Anstieg. Abbildung 3f zeigt das Stromrauschen (Ids-rms) für alle 64 Kanäle, gemessen bei 200 Hz über 4 Wochen. Bei dieser Frequenz ist es möglich, Veränderungen in der Empfindlichkeit des Aufzeichnungssystems aufgrund der geringen durchschnittlichen Leistung hochfrequenter neuronaler Signale abzuschätzen (siehe Zusatzinformation S4). Die in Abb. 3f dargestellten Zahlenwerte geben den Prozentsatz der funktionierenden g-SGFETs an (siehe Zusatzinformation S4). Der Frequenzgang der Transkonduktanz (gm(f)) wurde ebenfalls über 4 Wochen nach der Implantation in vivo gemessen. Zu diesem Zweck wurden zwei Pt-Ir-Elektroden auf beiden Seiten des g-SGFET-Arrays implantiert (siehe Einschub in Abb. 3g) und mit Hilfe einer Stromquelle reine Tonsignale mit einer Amplitude von 1 µA und unterschiedlichen Frequenzen angelegt. Abbildung 3g zeigt die Größe von gm(f) für verschiedene Tage nach der Implantation der neuronalen Sonde, normalisiert durch die mittlere Größe bei 1 Hz; die Phase von gm(f) ist in der Zusatzinformation S5 dargestellt. Die annähernd konstante Steigung (in einer log-log-Skala) folgt einer Abschwächung fraktionierter Ordnung (d. h. etwa ∝1/f0,1), die kürzlich der nicht idealen kapazitiven Reaktion der Graphen-Elektrolyt-Grenzfläche zugeschrieben wurde. Es wurde auch eine Kalibrierungsmethode zur Korrektur solcher Transkonduktanzschwankungen vorgeschlagen. Die Entwicklung des Frequenzgangs zeigt keine größeren Veränderungen in der Steigung der gm-Dämpfung, was darauf hindeutet, dass die elektrische Impedanz in Reihe mit der Graphen-Elektrolyt-Grenzfläche aufgrund der Verkapselung des Bauelements nicht wesentlich ansteigt. Abschließend zeigt Abb. 3g die aufgezeichnete neuronale Aktivität in einem Zustand erhöhter Theta-Leistung an Tag 1 und Tag 6 nach der Implantation, was die gute Homogenität und Stabilität der g-SGFETs verdeutlicht. Künftige Studien könnten durch die Untersuchung einer großen Tierkohorte die Stabilität des biologischen Signals im Laufe der Zeit genauer untersuchen, ein kritischer Aspekt in der elektrophysiologischen Forschung und für die langfristige Leistung von Gehirn-Computer-Schnittstellen. Darüber hinaus könnten die als Substrat und Passivierungsschichten verwendeten Polymere modifiziert werden, um die Feuchtigkeitsaufnahme zu verringern und die neutrale Ebene des Geräts an die Position des Graphenkanals zu verschieben (siehe Abschnitt „Methoden“). Die in diesem Abschnitt vorgestellten Ergebnisse zeigen jedoch eine vielversprechend stabile Leistung über die Zeit, was eine untere Grenze für die Stabilität von g-SGFETs in einer chronischen Implantatumgebung darstellt. Außerdem zeigen wir aus der Systemperspektive, dass g-SGFET-Arrays sehr langsame biologische Signale messen können (hochpassgefiltert über 1 mHz).

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Biokompatibilität von Graphen-Geräten nach subakuter und chronischer Implantation

Um die Anwendbarkeit von g-SGFET-Arrays für die langfristige Überwachung der Hirnaktivität bei natürlichem Verhalten zu bewerten, haben wir auch die Biokompatibilität von epikortikalen Graphen-Bauteilen untersucht. Zu diesem Zweck wurde den Tieren eines von drei Geräten in den parietalen Kortex des Gehirns implantiert oder die gesamte Operation ohne Implantation eines Gerätes durchgeführt (Scheinkontrolle). Eine Kohorte naiver Tiere, die keinen Eingriff erhielten, diente als Kontrolle. Zur Beurteilung der Gewebereaktion wurden drei Zeitpunkte gewählt: 2 Wochen, 6 Wochen und 12 Wochen nach der Implantation (Abb. 4a). Die nicht-funktionalen Geräte wurden mit einer vergrößerten Oberfläche aus CVD-Graphen versehen, um die Exposition des Materials gegenüber dem Hirngewebe zu maximieren (siehe Abb. 4b für die Abmessungen der Geräte). Die Experimente wurden in Anlehnung an die ISO-Norm 10993 konzipiert, in der die biologische Bewertung von Medizinprodukten beschrieben wird. Vor der Implantation wurde eine Sterilisation mit Ethylenoxid durchgeführt. Nach der Implantation wurden die immunhistochemische Reaktion des Gewebes und mögliche Auswirkungen auf das Verhalten untersucht.

Bild 4a Die Zeitleiste beschreibt die Verfahren, die während der Biokompatibilitätsstudie an Tieren durchgeführt wurden. b Schematische Darstellung des g-SGFET-Prototyps mit großer Oberfläche, der für Biokompatibilitätstests in vivo entwickelt wurde. c Diskriminierungsverhältnis aus dem NOR-Test über verschiedene Tage nach der Implantation (siehe Abschnitt „Methoden“). Bei allen fünf getesteten Gruppen lag das Unterscheidungsverhältnis zu allen Zeitpunkten über 0,5. Ausgewertet für n = 7 Tiere pro Gruppe zu allen Zeitpunkten, mit Ausnahme von 12 Wochen, bei denen n = 3 (Sham), n = 4 (Platin und naiv) und n = 7 (Blank). Die Kästchen reichen vom unteren bis zum oberen Quartil, während die Whisker die Minimal- und Maximalwerte darstellen. d Entzündungsmarker IL-17a im Hirngewebe für alle Gruppen und Zeitpunkte. Ausgewertet für n = 4 Tiere nach 2 und 12 Wochen und n = 3 Tiere nach 12 Wochen. e Mikroglia-Aktivierungsstatus, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Mikroglia-Präsenz in der Umgebung der Elektroden. n = 3 Tiere nach 2 und 12 Wochen, n = 2 Tiere (oder 3 für die kontralaterale Hemisphäre) nach 6 Wochen. Die Balken in den Feldern d und e geben den Mittelwert und den Bereich der Datenpunkte an. f Iba-1-Immunfluoreszenzfärbung zur Beurteilung des Aktivierungsstatus der Mikroglia an der Operationsstelle aus 40 Schnitten pro Tier. Der Maßstab entspricht 500 µm (50 µm in den Einschüben). g Die Hämotoxylin- und Eosin-Färbung 2 Wochen nach der Implantation zeigt, dass es keine strukturellen Schäden an den Kortikalschichten direkt an der Implantationsstelle des Geräts gibt. Vierzig Schnitte mit 25 µm pro Tier wurden abgebildet. Maßstabsbalken entsprechen 1 mm (oben) und 200 µm (unten). In den Feldern d und e Zwei-Wege-ANOVA-Test mit Dunnett’s multiplem Vergleich mit der naiven Kontrolle innerhalb jedes Zeitpunkts mit n = 3 oder größer: *, **, *** und **** bedeuten p = 0,015, p = 0,007, p = 0,0016, bzw. p < 0,0001.

Das Verhalten wurde mit dem NOR-Test (Novel Object Recognition) bewertet, der zur Beurteilung von Beeinträchtigungen der Kognition und des Gedächtnisses eingesetzt wird. Es wurden keine signifikanten Unterschiede im Unterscheidungsverhältnis bei den Tieren festgestellt, denen zu irgendeinem Zeitpunkt ein Gerät implantiert wurde (Abb. 4c). Die Entzündungsreaktion des Gewebes wurde mit zwei Haupttechniken bewertet: ELISA von Blut oder Hirngewebe für eine Reihe von Entzündungszytokinen und immunhistochemische Analyse von Hirngewebe für Zellen, die mit Entzündungen in Verbindung stehen. ELISA wurde für vier Zytokine durchgeführt: Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-17a (IL-17a), Interferon gamma (IFN-γ) und Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-a). Im Blutserum gab es zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Materialien (siehe Abb. S6). Was die Zytokinexpression im Hirngewebe anbelangt, so wurden sowohl bei den Graphen- als auch bei den Platingeräten zu einem Zeitpunkt von zwei Wochen signifikant höhere Werte aller vier Zytokine im Vergleich zur kontralateralen Hemisphäre festgestellt. Während die Freisetzung dieser Faktoren in der Regel dazu dient, eine weitere Schädigung des ZNS-Gewebes zu verhindern, kann eine anhaltende Expression schädlich sein. 6 Wochen nach der Implantation war die Expression von IL17a und IFN-γ bei den Graphen- und Platin-Vorrichtungen im Vergleich zur Kontrollgruppe immer noch signifikant erhöht, und in Woche 12 gab es in keiner der Behandlungsgruppen eine signifikante Expression eines Zytokins (Abb. 4d und Abb. S7). Diese Ergebnisse zeigen, dass die unerwünschte Gewebereaktion auf Graphen vorübergehender Natur ist, vergleichbar mit dem derzeitigen klinischen Standard und spezifisch für die Implantationsstelle, ohne dass systemische Komplikationen beobachtet werden.

Zur Bestätigung der ELISA-Daten wurde auch eine manuelle Zählung des Aktivierungszustands der Mikrogliazellen durchgeführt, um den Entzündungszustand im Gehirn zu bewerten. Mikrogliazellen sind im Gehirn immer vorhanden, aber ihre Morphologie dient als Indikator für den Entzündungszustand im Gehirn. Die Expression aktivierter Mikroglia war sowohl 2 Wochen als auch 6 Wochen nach der Implantation erhöht, und diese Aktivierung war 2 Wochen nach der Implantation in allen vier Behandlungsgruppen im Vergleich zur kontralateralen Hemisphäre in signifikantem Ausmaß vorhanden. Ähnlich wie beim ELISA war die Aktivierung der Mikroglia jedoch nach 12 Wochen wieder auf das Ausgangsniveau zurückgegangen, was darauf hindeutet, dass es keine anhaltende Entzündungsreaktion auf die Geräte gab (Abb. 4e, f und Abb. S8). Es wurde auch eine TUNEL-Zellzählung durchgeführt, um den Zelltod im Gewebe als Folge der Implantation der Geräte zu beurteilen. 2 Wochen nach der Implantation war ein signifikanter Anstieg der Zahl der TUNEL-positiven Zellen sowohl in der Graphen- als auch in der scheinchirurgischen Gruppe zu verzeichnen. Nach 6 Wochen gab es jedoch keine Anzeichen für einen Zelltod, was auch nach 12 Wochen noch der Fall war (Abb. S9). Bei der Hämotoxylin- und Eosinfärbung wurden keine offensichtlichen morphologischen Veränderungen festgestellt. In einigen Gehirnen zeigte sich eine eingesunkene Kortikalis, was jedoch auf die Perfusionsfixierung bei eingesetztem Glasfenster zurückzuführen war und keinen Einfluss auf die Dicke der Kortikalisschichten unterhalb der Implantationsstelle hatte, wie in Abb. 4g gezeigt.

Insgesamt zeigten sowohl die Zytokinexpression als auch die histologische Analyse des Gehirnbereichs an der Implantationsstelle eine akute Reaktion auf die Implantation der Geräte. Diese war jedoch nicht spezifisch für die Graphen-Geräte, obwohl eine vergrößerte Graphen-Oberfläche verwendet wurde, um die materialspezifische Reaktion zu maximieren. Nach 6 Wochen zeigte die Reaktion deutliche Anzeichen einer Besserung, und nach 12 Wochen war bei keiner Technik mehr eine Reaktion auf die Geräte nachweisbar. Graphen- und Pt-Bauteile zeigten ein ähnliches Ausmaß an Mikroglia-Aktivierung im Vergleich zu „leeren“ Bauteilen, während letztere eine viel geringere Präsenz von Entzündungsmarkern als bei Graphen oder Pt aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mikroglia-Aktivierung stärker mit dem chirurgischen Eingriff und dem Einsetzen der Sonde zusammenhängt, während die Entzündung in erster Linie durch das Material der Vorrichtung beeinflusst wird. Auf diese Weise wird erwartet, dass funktionale Sensor-Arrays, die eine viel geringere Graphenfläche aufweisen, eine Entzündung verursachen, die der von „leeren“ Geräten näher kommt. Darüber hinaus hatten die Graphen-Bauteile laut NOR-Test weder bei akuten noch bei chronischen Zeitpunkten einen signifikanten Einfluss auf das Verhalten der Tiere. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wiesen Vorrichtungen auf Graphenbasis eine angemessene Biokompatibilität für die chronische Implantation auf, vergleichbar mit den entsprechenden Vorrichtungen auf Platinbasis.

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Langzeitbeobachtung der epikortikalen Hirnaktivität im breiten Frequenzband während des natürlichen Verhaltens

Während der longitudinalen in vivo-Bewertung der g-SGFET-Empfindlichkeit zeichneten wir die epikortikale Hirnaktivität einer sich frei verhaltenden Ratte bis zu 24 Stunden lang auf. Während der gesamten Aufzeichnungsdauer wurde die 3D-Bewegung des Tieres mit einem Motion-Capture-System (Mocap) verfolgt (siehe Abschnitt „Methoden“ und Abb. 5a). Die konjunktive Aufzeichnung von Tierbewegungen und epikortikalen Signalen mit breitem Frequenzband wurde zur Klassifizierung von Hirnzuständen und Verhaltenszuständen während des Aufzeichnungszeitraums verwendet. Diese Klassifizierung wurde wiederum für zwei Hauptzwecke verwendet. Erstens sollte die Fähigkeit des drahtlosen Aufzeichnungssystems auf Graphenbasis zur Durchführung langfristiger stabiler Aufzeichnungen bei sich frei bewegenden Ratten über mehrere Hirnzustände hinweg validiert und seine Eignung zur Untersuchung der infra-langsamen epikortikalen LFP-Dynamik getestet werden. Zweitens sollte die g-SGFET-Empfindlichkeit im hochfrequenten Bereich der LFP-Dynamik im Zusammenhang mit spontanem Verhalten bewertet werden. Die Analyse der Beziehungen zwischen epikortikaler Hirnaktivität und frei beweglichem Verhalten wurde auf Zeitskalen durchgeführt, die durch das drahtlose Aufzeichnungssystem ermöglicht wurden. Diese Fähigkeit ist entscheidend für die Untersuchung von spärlich auftretenden Verhaltensereignissen sowie von ISA-Mustern über verschiedene Gehirnzustände hinweg.

Bild 5a 3D-Trajektorien der Kopfposition der Ratte. Das Inset zeigt ein Schema der Mocap-Position. b Das Spektrogramm und das LFP-Rohsignal eines illustrativen Kanals wird für verschiedene Hirnzustände angezeigt (oben): Slow-Wave (SW), High-Voltage-Spindles (HVS) und Theta. Die Bewegungsgeschwindigkeit wird zusammen mit der Klassifizierung des motorischen Zustands (Mitte) und des Gehirnzustands (unten) angezeigt. c Oben: prozentualer Anteil der Zeit im aktiven gegenüber dem inaktiven Zustand (Unterbrechungen zum Batteriewechsel nicht berücksichtigt). Unten: prozentualer Anteil der Zeit, in der sich die Ratte in den einzelnen Haupthirnzuständen befand. d Durchschnittliches 0,015-4-Hz-Spektrogramm für einen DC-Kanal, der bei Beginn der REM-Episode ausgelöst wurde (n = 44). e Median der PSD über SWS-REM-Übergangsepisoden (n = 44) für 30-Sekunden-Perioden vor und nach Beginn der REM-Phase. Der schattierte Bereich markiert Frequenzbereiche mit signifikantem Unterschied (p < 0,05, Permutationstest). f Farbkodierte Stärke der Modulation der LFP-Leistung im langsamen Frequenzbereich (y-Achse) für einen Kanal durch die Phase der ISA im Bereich von 0,05-0,2 Hz, abgeleitet von einem DC-Kanal (siehe Tafel g) während REM-Schlaf (links) und SWS (rechts). Graue Farbe zeigt eine nicht signifikante Modulation an. Die Einschübe zeigen eine kreisförmige Darstellung der LFP-Leistung im Theta-/Spindelband als Funktion der ISA-Phase. g Farbkodierte topographische Karten der ISA-Phasenmodulation der LFP-Leistung im Theta-Band während REM (links) und im Spindelband während SWS (rechts). Die vom DC-Kanal abgeleitete ISA-Phase ist mit einem roten Quadrat markiert. h Farbkodierte Stärke der Modulation der LFP-Leistung im Gamma-Frequenzbereich (y-Achse) für einen Kanal durch die von einem DC-Kanal abgeleitete ISA-Phase im Bereich von 0,05-0,2 Hz (links) und durch die Phase der LFP im langsamen Frequenzbereich (rechts) während der REM-Phase. Inset, kreisförmiges Diagramm der LFP-Gammaleistung in Bezug auf die jeweilige (ISA- oder Theta-) Phase. i Durchschnittliches Spektrogramm für den Hochfrequenzbereich der LFP auf dem hinteren Kanal, ausgelöst bei Beginn des Aufstehens (n = 162). j Kopfhöhe (unten) und hohe Gammaleistung (oben, gleicher Kanal wie in i), farbkodiert und zentriert auf den Beginn des Aufstehens, dargestellt für alle Ereignisse, sortiert nach Dauer des Aufstehens.

Die Gehirnzustände wurden durch eine Kombination von spektralen Merkmalen im epikortikalen LFP-Signal und motorischen Daten klassifiziert. Auf diese Weise wurden die folgenden Klassen unterschieden: langsamer Schlaf (SWS), REM-Schlaf (REM), Wach-Theta (AwT) und Wach-Nicht-Theta (AwNT). Abbildung 5b veranschaulicht die Kriterien für die Klassifizierung der Gehirnzustände, die im Abschnitt „Methoden“ ausführlich beschrieben werden. Zunächst wurden Zustände mit langsamen Wellen (SW), die eine erhöhte Leistung im Bereich von 1-25 Hz aufweisen, und Theta-Zustände identifiziert (siehe Abb. 5b). Das Verhalten des Tieres wurde dann anhand der Motion-Tracking-Daten in aktive und inaktive Perioden eingeteilt (siehe Abb. 5b und Abschnitt „Methoden“). Während des inaktiven motorischen Verhaltens wurden SW-Zustände als SWS klassifiziert, es sei denn, sie lagen in unmittelbarer Nähe zu HVS-Ereignissen, während Theta-Zustände als REM kategorisiert wurden, wenn ihnen SWS unmittelbar vorausging. Andererseits wurden Theta-Zustände, die während eines aktiven Verhaltens auftraten, als AwT und SW-Zustände als AwNT klassifiziert. Schließlich wurden Perioden, die weder einem Theta- noch einem SW-Zustand zugeordnet wurden, unabhängig vom Verhalten des Tieres als AwNT klassifiziert. Während der meisten Stunden der Aufzeichnung traten alle vier Schlaf-/Wachzustände mindestens einmal auf, was der polyphasischen Natur des Rattenschlafs entspricht66,67,68. Ihre relative Bedeutung schwankte jedoch im Laufe des Aufzeichnungstages erheblich, parallel zu den Veränderungen, die bei den motorischen Zuständen beobachtet wurden (Abb. 5c), was mit der zirkadianen Rhythmik übereinstimmt.

Die Klassifizierung von Hirnzuständen basiert in der Regel auf den Delta-, Alpha-Beta- und Theta-Frequenzbändern (siehe Abschnitt „Methoden“), die die zustandsspezifische Netzwerkdynamik auf einer schnellen Zeitskala widerspiegeln. Einige neuere Forschungsarbeiten haben jedoch die Rolle der infra-langsamen Dynamik bei der Regulierung von Unterzuständen des Gehirns durch die Modulation höherer LFP-Frequenzbänder während des Schlafs und die dynamische Koordination und Segregation des Ruhezustands hervorgehoben. Diese Ergebnisse zeigen die potenzielle Bedeutung von ISA für eine vollständige Klassifizierung und Untersuchung von Hirnzuständen. Das hier vorgestellte Graphen-basierte Aufzeichnungssystem ist ein ideales Werkzeug für die Untersuchung kortikaler ISA-Signale mit hoher Genauigkeit und räumlicher Auflösung bei frei verhaltenden Tieren. Das Spektrogramm in Abb. 5b zeigt die Veränderungen der spektralen Leistung für Frequenzen zwischen 0,015 und 4 Hz beim Übergang zwischen SWS und REM. Es ist ein deutlicher Anstieg der Leistung im ISA-Band nach dem Übergang von SWS zu REM zu beobachten, sogar auf der Ebene der einzelnen Versuche (siehe Abb. 5b). Unter Ausnutzung der Langzeitaufzeichnungsmöglichkeiten unseres Systems konnten wir innerhalb von 24 Stunden solcher spärlich auftretenden SWS-REM-Zustandsübergänge (REM-Dauer länger als 40 s) erfassen. Die räumliche Abbildung der ISA, die durch die g-SGFET-Technologie ermöglicht wird, erlaubt es außerdem, die topografische regionsspezifische Modulation der ISA beim Übergang vom SWS- in den REM-Zustand aufzulösen (siehe ergänzende Informationen S12). Interessanterweise zeigten die Delta-Band-Leistung, die mit langsamen Oszillationen assoziiert ist, und die Infra-Slow-Leistung Veränderungen in entgegengesetzter Richtung zwischen SWS und REM-Schlaf. Während die Delta-Band-Leistung erwartungsgemäß von SWS zu REM abnimmt, was mit einem desynchronisierten kortikalen Zustand einhergeht, nimmt die Infra-Slow-Leistung in REM zu (siehe Abb. 5d, e und Abb. S12 sowie die statistische Analyse in „Methoden“).

Um die Empfindlichkeit des Aufzeichnungssystems für ein breites Frequenzband weiter zu veranschaulichen, haben wir die Stärke der Modulation der LFP-Leistung im langsamen Frequenzbereich (1-15 Hz) durch die Phase der ISA-Aktivität während REM und SWS quantifiziert. Interessanterweise modulierte die ISA-Phase signifikant die Theta-Leistung (8-9 Hz) während des REM-Schlafs (Abb. 5f-links) und die Spindelbandleistung (9-13 Hz) während des SWS (Abb. 5f-rechts). Die Stärke der ISA-Phasenmodulation war während der REM-Phase zehnmal höher als während des SWS-Schlafs, und die ISA-Phase der maximalen LFP-Leistung unterschied sich zwischen den Zuständen, wobei sie in der REM-Phase nahe dem Peak (~ 340°) und in der SWS-Phase aufsteigend (~ 300°) war. Da unser Array einen bedeutenden Teil des dorsalen Kortikalmantels abdeckt, konnten wir das räumliche Ausmaß der ISA-Phasenmodulation der LFP-Leistung im gesamten Kortex untersuchen, wobei sowohl die Theta-Leistung während der REM-Phase als auch die Spindel-Leistung während der SWS-Phase die stärkste Modulation im hinteren Teil des Arrays zeigten (Abb. 5g). Während die an der kortikalen Oberfläche gemessenen Theta-Oszillationen durch die Volumenleitung multipler theta-rhythmischer Stromgeneratoren entorhino-hippocampaler Schaltkreise erzeugt werden, werden Schlafspindeln durch rhythmische Ströme thalamo-kortikaler Projektionen zu granulären kortikalen Schichten erzeugt. Die Tatsache, dass die Stärke des hippocampalen Theta- und des kortikalen Spindelbandes durch die Phase der von der kortikalen Oberfläche abgeleiteten ISA moduliert wird, spiegelt wahrscheinlich eine globale infra-langsame Dynamik wider, die sowohl die limbischen als auch die kortikalen Schaltkreise mitmoduliert. Während das topografische Profil der Modulation der Theta-Leistung (Abb. 5g) durch die ISA-Phase mit der anatomischen Lokalisation der zugrundeliegenden Theta-Stromgeneratoren im Hippocampus übereinstimmt, könnte die stärkere Modulation der Spindelleistung in posterioren kortikalen Bereichen anatomische thalamo-kortikale Subschaltkreise widerspiegeln, die stärker durch die ISA-Dynamik als durch das epikortikale DC-Signal co-moduliert werden. Schließlich testeten wir, ob das SNR der g-SGFETs ausreicht, um Fluktuationen in der hochfrequenten LFP-Dynamik auf verschiedenen Zeitskalen zu erkennen, und quantifizierten zu diesem Zweck die Stärke der Modulation der Gamma-Leistung im weiten Bereich (30-200 Hz) sowohl durch die ISA-Phase als auch durch die Theta-Rhythmusphase während des REM-Schlafs. Die Gammaleistung im Bereich von 60-120 Hz wurde durch die ISA-Phase moduliert und erreichte ihr Maximum bei der Spitze des ISA (~10°) (Abb. 5h-links), und in Übereinstimmung mit veröffentlichten Arbeiten, die auf intrakraniellen Aufzeichnungen basierten, wurde die hohe Gammaleistung (120-150 Hz) durch die Theta-Phase moduliert (Abb. 5h-rechts).

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Nachdem wir festgestellt hatten, dass wir mit g-SGFETs zustandsselektive epikortikale Signale über eine Reihe von Hirn-/Motorzuständen aufzeichnen können, haben wir anschließend die Anwendbarkeit der Technik für die Verknüpfung von Verhalten und kortikaler Physiologie demonstriert. Zu diesem Zweck konzentrierten wir uns auf ein spezifisches und nur selten auftretendes Spontanverhalten, das Aufrichten an den Hinterbeinen. Das Aufrichten ist ein Erkundungsverhalten bei Nagetieren, das kontext- und stresssensitiv ist, und von dem angenommen wurde, dass es die Erfassung distaler Orientierungspunkte für den Aufbau eines kognitiven Modells der Umgebung unterstützt und in die Modulation der kortikalen und hippokampalen Interaktionen in Theta- und Gamma-Frequenzen eingebunden ist. Aufgrund des sporadischen und spontanen Auftretens von Aufzuchtsereignissen wurde deren neuronale Physiologie mit herkömmlichen Aufzeichnungsmethoden im Vergleich zu aufgabenspezifisch trainierten motorischen Handlungen im Allgemeinen weniger umfassend untersucht. Technologien, die Langzeitaufzeichnungsstabilität, hohe räumliche Auflösung, drahtlose Methodik und präzise 3D-Verfolgung des Tierverhaltens kombinieren, wie sie hier vorgestellt wurden, eröffnen die Möglichkeit, diese Klasse von Phänomenen mit einem hohen Detailgrad zu untersuchen. Daher nutzten wir die vorgestellte Technologie, um eine große Anzahl einzelner spontaner Aufzuchtsereignisse über einen vollen Zeitraum von 24 Stunden zu erfassen. Die Auswertung der Signatur des Aufziehens auf dem epikortikalen Gamma-Aktivitätsband ist für unsere Studie von zusätzlichem Interesse, da sie zur Veranschaulichung der Fähigkeiten der g-SGFETs im hochfrequenten LFP-Bereich verwendet werden kann. Um Aufsteh-Episoden zuverlässig zu erkennen, nutzten wir die Vorteile der kontinuierlichen 3D-Verfolgung und erkannten Aufsteh-Ereignisse (n = 163) anhand der Höhe des Kopfes über dem Boden (siehe „Methoden“ und ergänzende Informationen S6). Obwohl Aufstehvorgänge während des gesamten Aufzeichnungszeitraums auftraten, war die Ausprägung der Aufstehaktivität über den Tag hinweg sehr variabel, wie auch die gesamte motorische Aktivität, die von 250 s bis 0 s Aufstehzeit pro Stunde reichte (Mittelwert 43,8 ± 12,1 s, Zusatzinformation S10). Darüber hinaus variierten die Aufzuchtsereignisse in Bezug auf die Höhe (durchschnittlich 250,6 ± 2,7 mm, siehe Abb. 5j und Abb. S10d) und die Dauer (durchschnittlich 5,7 ± 2,8 s, siehe Abb. S10e).

Nachdem wir diese Reihe spontaner Aufziehepisoden entdeckt hatten, analysierten wir die Leistungsspektren der epikortikalen LFP, die für bestimmte Frequenzbereiche deutliche, mit dem Aufziehen assoziierte Veränderungen der Gehirnsignale zeigten. Das Aufbäumen war mit einer Unterdrückung der epikortikalen hochfrequenten (90-200 Hz) Aktivität verbunden (Abb. 5i), die auch auf der Ebene der einzelnen Versuche über den gesamten Bereich der Aufbäumhöhe (Abb. 5j) zu beobachten war und am deutlichsten auf den frontaleren Kanälen unseres Arrays auftrat (siehe Zusatzinformation S11). In starkem Kontrast dazu wurde im Gamma-Band zwischen 60 und 70 Hz keine derartige Unterdrückung beobachtet (siehe Abb. 5i und ergänzende Informationen S11).

Anschließend nutzten wir die Fähigkeit der g-SGFET-Arrays zur Infra-Slow-Aufzeichnung, um topografische Infra-Slow- und spektrale epikortikale AC-Signale zu charakterisieren, die mit seltenen, hochsynchronen Hochspannungsspindel-Oszillationen (HVS) verbunden sind, die höchstwahrscheinlich mit großen Infra-Slow-Strömen in der Kortikalis einhergehen, ähnlich denen, die bei epileptiformer Aktivität in der Entwicklung auftreten. In Übereinstimmung mit früheren Studien wurde das Auftreten von HVS hauptsächlich mit wachen Immobilitätszuständen (IMM) in Verbindung gebracht (566 Ereignisse, Abb. 6a), wobei IMM als Schnittpunkt zwischen inaktiven und wachen Zuständen definiert ist. Dank der ungestörten Langzeitaufzeichnung, die unser System ermöglicht, konnten wir auch eine signifikante Anzahl von HVS-Ereignissen während des REM-Schlafs erfassen (92 Ereignisse), wo sie mit hippokampalen Theta-Oszillationen koexistierten, die auf den hinteren Ableitungen sichtbar sind (Abb. 6b). Während die mediane Dauer der HVS-Ereignisse in Immobilität und REM-Schlaf vergleichbar war (~5 s, Abb. 6c-oben), variierte die Rate der entdeckten HVS-Ereignisse über den aufgezeichneten Zeitraum von 24 Stunden (Abb. 6c-unten). Interessanterweise waren die HVS während beider Gehirnzustände mit vorübergehenden infra-langsamen Fluktuationen verbunden, wie in einzelnen Beispielen (Abb. 6a, b) und Durchschnittsprofilen (Abb. 6d, e) zu sehen ist. Insbesondere stimmten positive (mutmaßliche Quelle) und negative (mutmaßliche Senke) infra-langsame Transienten in posterioren bzw. frontalen Positionen auf dem Array in ihrer Dauer (Median 5 s) mit der oszillatorischen Dynamik der HVS überein (Abb. 6c, d, e). Die topographischen Profile der spektralen Spitzenleistung der HVS waren für beide Zustände vergleichbar und zeigten einen maximalen Anstieg gegenüber der Basislinie in den frontalen Ableitungen, die den sensorisch-motorischen Kortex überlagern (Abb. 6f). REM-assoziierte HVS waren im Durchschnitt langsamer und leistungsstärker als immobilitätsassoziierte (Wilcoxon-Rangsummentest, p < 1e-19 für Leistung und p < 1e-8 für Frequenz, Abb. 6g). Im Gegensatz dazu waren die räumliche Struktur und das Ausmaß der mit HVS assoziierten infra-langsamen Fluktuationen, ausgedrückt durch positive Fluktuationen auf den posterioren und negative Fluktuationen auf den frontalen DC-Kanälen, für beide Zustände vergleichbar (Wilcoxon-Ranksum-Test zwischen IMM und REM, p = 0,5 für die posteriore Spitzengröße und p = 0,9 für die frontale Troggröße, Abb. 6h).

Bild 6a, b Beispiele für HVS-Ereignisse während Immobilität (a) und REM-Schlaf (b). Spektrogramme an posterioren (oben) und anterioren (Mitte) Positionen auf dem Array visualisieren die Dynamik von HVS (vertikale Linien bei Onsets) und die laufende oszillatorische Dynamik (niederfrequente Synchronie in IMM, Theta-Oszillation in REM). Die beiden unteren Panels zeigen DC-LFP-Signale von hinteren (grün) und vorderen (braun) Positionen auf dem Array und die Kopfgeschwindigkeit. c Verteilung der Dauer einzelner HVS-Ereignisse für Immobilität und REM (oben) und stündliche Gesamtdauer der HVS über den aufgezeichneten Zeitraum (unten). d Durchschnittliche DC-LFP-Kurven, die bei HVS-Ereignissen während Immobilität und REM-Schlaf ausgelöst werden (Kanäle wie in Abb. 2g-links angeordnet, Inset zeigt die anatomische Lokalisierung der DC-EKoG-Aufzeichnungsstellen). e Durchschnittliche AC-LFP-Spektrogramme, die bei HVS-Ereignissen während Immobilität (links) und REM-Schlaf (rechts) ausgelöst werden. Die Spektrogramme an posterioren (oben) und anterioren (unten) Positionen auf dem Array kontrastieren den spektralen Inhalt, der mit Theta- (posterior) bzw. HVS-Oszillationen (anterior) verbunden ist. Pseudo-Farbe, spektrale Leistung (a.u.). f Topografische Karten der Veränderung der HVS-Leistung bei der Spitzenfrequenz der Oszillation während der Immobilität (links) und des REM-Schlafs (rechts) im Vergleich zum Ausgangswert. g Verteilungen der Leistung und der Spitzenfrequenz einzelner HVS während der Immobilität (blau) und des REM-Schlafs (rot). h Verteilung der DC-Fluktuationsgröße an den posterioren lateralen und frontalen medialen Ableitungen für einzelne HVS während der Immobilität und REM (Farbcode wie in g).

Obwohl zukünftige Arbeiten erforderlich sind, um diese Beobachtungen in einer großen Kohorte von Tieren zu wiederholen, ermöglichten unsere Langzeitaufzeichnungen eine detaillierte quantitative Analyse seltener physiologischer Muster und veranschaulichen die Leistungsfähigkeit dieser Technologie. Aufgrund ihres spärlichen, stark zustandsabhängigen Auftretens und ihrer Verteilung über ein breites Frequenzband veranschaulichen diese Ereignisse die Klasse von Phänomenen, deren funktionelle Untersuchung die Integration von neuronal-behavioralen Messungen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung und großer räumlich-zeitlicher Spannweite bei sich frei bewegenden Tieren erfordert, wie es unser drahtloses Elektrophysiologiesystem ermöglicht.

Diskussion

Aktive Graphen-Sensor-Arrays stellen eine aufstrebende Technologie im Bereich der Neuraltechnik dar, die in jüngster Zeit ein großes Potenzial für die Herstellung von Sensor-Arrays mit hoher Anzahl von Sensoren sowie für die neuronale Erfassung eines breiten Frequenzbandes gezeigt hat. In diesem Artikel haben wir eine detaillierte Charakterisierung verschiedener technischer Aspekte vorgestellt, die für ihre tatsächliche Anwendung erforderlich sind, wie z. B. die Homogenität der Leistung der Graphen-Sensoren, die für eine spezielle Kopfbühne erforderlichen Spezifikationen, die Grenzen der Empfindlichkeit von g-SGFETs oder ihre chronische Stabilität und Biokompatibilität in vivo, und wir haben Untersuchungslinien aufgezeigt, die durch ihre technischen Eigenschaften ermöglicht werden.

Erstens haben wir die hohe Ausbeute und Homogenität der g-SGFETs nachgewiesen, die in einem Wafer-Scale-Verfahren unter Verwendung von handelsüblichem CVD-Graphen hergestellt wurden. Diese Demonstration ist ein wichtiger Meilenstein auf dem Weg zur Herstellung von neuronalen Sonden auf Graphenbasis in industriellem Maßstab. Auf der anderen Seite erfordert die Anwendung von Graphen-Transistoren für neuronale Sensoren auch die Entwicklung spezifischer elektronischer Geräte für die Vorspannung der Sensoren und die Umwandlung der gemessenen Drain-Source-Ströme in entsprechende Spannungssignale am Gate. In dieser Studie haben wir eine spezielle drahtlose Kopfbühne vorgestellt, mit der die Auswirkungen der Signalverstärkung und des Digitalisierungsprozesses auf die Empfindlichkeit des Aufzeichnungssystems beschrieben werden konnten. Auf diese Weise haben wir die Herausforderungen bei der Entwicklung von Vollbandverstärkern unter Berücksichtigung spezifischer Energie- und Gewichtsbeschränkungen für drahtlose Anwendungen ermittelt. Darüber hinaus haben wir mit Hilfe einer speziellen Kopfbühne gezeigt, dass die Empfindlichkeit aktiver Graphen-Sensoren im ISA-Band nicht wesentlich von den übrigen Komponenten des Datenerfassungssystems beeinflusst wird. Dennoch beobachteten wir in vivo langsame Drifts in den gemessenen Signalen, die vermutlich auf die Adsorption geladener Moleküle am Graphenkanal oder auf Drifts im Referenzpotential der Elektrode zurückzuführen waren. Diese Drifts konnten leicht mit einem Hochpassfilter bei 1 mHz eliminiert werden. Zukünftige Experimente könnten jedoch die Funktionalisierung des Graphenkanals und die Verwendung alternativer Referenzelektroden untersuchen, um ein stabileres Dotierungsniveau aufrechtzuerhalten.

Darüber hinaus haben wir die Stabilität der Graphen-Sensoren in vivo nachgewiesen, indem wir ihre Empfindlichkeit über 4 Wochen charakterisiert haben. Um die Stabilität der Signalqualität zu bestimmen, haben wir auch die durch bipolare Stimulation im LFP-Frequenzband induzierten Signale ausgewertet und dabei einen recht stabilen Frequenzgang über die Zeit nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Impedanz des Gliagewebes, das das Implantat umgibt, die Empfindlichkeit der g-SGFETs in vivo nicht wesentlich beeinflusst. Um die Charakterisierung der Stabilität der Geräte abzuschließen, haben wir die Biokompatibilität der Graphengeräte über 12 Wochen anhand von Verhaltens- und histologischen Markern untersucht. Diese Ergebnisse zeigen eine akute Fremdkörperreaktion, die mit platinbasierten Vorrichtungen vergleichbar ist und 12 Wochen nach der Implantation zu Werten zurückkehrt, die denen von Kontrolltieren nahe kommen. Die Demonstration der Biokompatibilität und Langzeitstabilität von Graphen in einem chronischen Implantat stellt einen weiteren wichtigen Wendepunkt auf dem Weg zu einer groß angelegten Produktion von neuronalen Sonden auf Graphenbasis dar.

Die experimentelle Validierung dieser Technologie eröffnet viele Möglichkeiten für elektrophysiologische Studien, bei denen der Zugang zu uneingeschränktem Verhalten und mehrkanaligen Aufzeichnungen mit Empfindlichkeit in einem breiten Frequenzband wichtig ist. In dieser Studie haben wir eine quasi-kontinuierliche Überwachung der Gehirnaktivität in langen Aufzeichnungssitzungen von bis zu 24 Stunden gezeigt, die es uns ermöglichte, große Stichproben der neuronalen Aktivität über ungestörte Verhaltens- und Gehirnzustände hinweg zu erfassen. In Kombination mit 3D-Tracking ermöglichte uns die drahtlose Technologie, die Beziehung zwischen neuronalen Aktivitätsmustern und Verhaltensereignissen, die im Laufe der Zeit nur spärlich auftreten, mit ausreichender statistischer Aussagekraft zu untersuchen. Insbesondere bei der Analyse der epikortikalen LFP-Signale in Bezug auf das Aufziehverhalten beobachteten wir eine differentielle Modulation des 60-70 Hz-Gamma- und des 90-200 Hz-Hoch-Gamma-Bereichs. Während die hochfrequente Aktivität zwischen 90 und 200 Hz durchgängig topographisch unterdrückt wurde, wurde für den Bereich von 60-70 Hz keine derartige Unterdrückung beobachtet, was auf eine ausgeprägte Verhaltensselektivität der zugrunde liegenden Schaltkreismechanismen hindeutet. Die Feststellung einer frequenzspezifischen Leistungsmodulation im Gammabereich, sogar für einzelne Aufzuchtsereignisse, zeigt die hohe Empfindlichkeit des Systems im hochfrequenten Spektrum des LFP.

Im niederfrequenten Bereich stellten wir fest, dass die Leistung der Infra-Slow-Dynamik <0,2 Hz während REM-Schlafepisoden im Vergleich zu SWS an allen DC-Standorten signifikant anstieg und somit eine entgegengesetzte Zustandsabhängigkeit als die Leistung im Bereich der langsamen Oszillation (1-4 Hz) aufwies. Interessanterweise modulierte die Infra-Slow-Dynamik die Leistung des Theta- und Gamma-Rhythmus während der REM-Phase und mit geringerer Stärke die Leistung der Schlafspindeln während des SWS. Während die Modulation der LFP-Leistung in den Theta-, Beta- und Gamma-Bändern durch die aus dem BOLD-Signal und dem DC-EEG abgeleitete ISA-Phase beim Menschen und kürzlich bei betäubten Ratten nachgewiesen wurde, ist das vorliegende Ergebnis der erste Nachweis einer Interaktion zwischen der physiologisch etablierten oszillatorischen Dynamik, den Theta-, Spindel- und Gamma-Oszillationen und der aus dem EKG abgeleiteten ISA bei sich frei bewegenden Nagern. In Übereinstimmung mit veröffentlichten intrakraniellen Arbeiten modulierte das an der kortikalen Oberfläche gemessene Theta-Volumen des Hippocampus auch die kortikale Gamma-Leistung, was zeigt, dass die entwickelte Technologie ausreichend empfindlich ist, um bekannte Gamma-Dynamiken zu charakterisieren.

Während die Leistung der ISA, die die Oszillationen der Schlafspindel moduliert, während der SWS viel geringer war als während der REM-Phase, war ein verwandter hypersynchroner thalamo-kortikaler Rhythmus, HVS, mit viel größeren DC-Transienten verbunden. Durch langfristige drahtlose Aufzeichnungen konnten wir die Eigenschaften von HVS in einer großen statistischen Stichprobe von Ereignissen bewerten. Die Häufigkeit des Auftretens während verschiedener Hirnzustände konnte über einen Zeitraum von 24 Stunden bestimmt werden, wobei ihr Auftreten auch außerhalb des wachen Ruhezustands, in dem sie Berichten zufolge selektiv auftreten, deutlich wurde. Insbesondere fanden wir heraus, dass sie während des REM-Schlafs besonders stark ausgeprägt sind. Nachdem wir diese bimodale Zustandsspezifität festgestellt hatten, analysierten wir die HVS-Ereignisse getrennt für wache Unbeweglichkeit und REM-Schlaf. Die topografische Analyse der HVS-Spitzenleistung zeigte, dass die sensorisch-motorische kortikale Prävalenz dieser Oszillationen in diesen beiden Zuständen vergleichbar ist. Im Gegensatz dazu konnte aufgrund der großen Anzahl von Ereignissen in beiden Zuständen ein signifikanter Unterschied sowohl im Frequenzgehalt als auch in der Leistung der HVS zwischen diesen beiden Gehirnzuständen festgestellt werden. Darüber hinaus ermöglichte die Fähigkeit, ISA-Muster gleichzeitig abzubilden, die Bestimmung der ausgeprägten topografischen Struktur von räumlich spezifischen, mit HVS assoziierten infra-langsamen Frequenzkomponenten, die eine Phasenumkehr über die anterio-posteriore Achse aufweisen. Wichtig ist, dass diese ISA-Merkmale zwischen REM-Schlaf und wacher Unbeweglichkeit konserviert wurden, was unterstreicht, dass der zugrundeliegende Ursprung des DC-Signals mit dem HVS-Ereignis selbst zusammenhängt und unabhängig vom Gehirnzustand ist.

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Zukünftige Arbeiten sind erforderlich, um die vorgestellten Ergebnisse in einer großen Kohorte von Tieren zu wiederholen, sie in Längsrichtung zu verfolgen und das Oberflächenmuster mit intra-laminaren und subkortikalen Theta-, Spindel-, Gamma- und HVS-Generatoren in Beziehung zu setzen. Obwohl wir uns auf epikortikale ISA-Muster konzentriert haben, könnte die Analyse ihrer Korrelation mit der ISA-Dynamik über kortikale Laminae hinweg wichtige Einblicke in den Ursprung und die Auswirkungen von ISA liefern. Eine vielversprechende Strategie in diese Richtung ist die Kombination der hier vorgestellten epikortikalen Arrays mit Tiefensonden auf Graphenbasis. Künftige chronische Aufzeichnungen von Tiefen- und großräumigen LFP-Signalen über Verhaltensweisen und Verhaltenszustände hinweg bei sich frei bewegenden, unbehinderten Tieren werden den Grundstein für einen neuen qualitativen Schritt in der Untersuchung der Hirndynamik von infra-langsamen bis zu sehr schnellen Frequenzen72 legen und zu unserem Verständnis der Ursprünge der ISA-Dynamik im Kontext von Ruhezuständen und Default-Mode-Netzwerken sowie ihrer Verbindungen zu schnelleren Hirndynamiken beitragen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die gründliche In-vitro- und In-vivo-Evaluierung der Erfassungs- und Langzeitaufzeichnungsfähigkeiten aktiver Graphen-Sensoren aus einer Systemperspektive die Reife dieser Technologie demonstriert und ihre Anwendung für die Untersuchung von ISA unterstützt, ohne dass hochfrequente LFP-Komponenten geopfert werden müssen. In dieser Richtung haben wir erfolgreich ISA-Muster während verschiedener Gehirnzustände und die Korrelation von hochfrequenten Oszillationen mit spezifischen, spärlich auftretenden Verhaltensweisen untersucht. Unsere Ergebnisse stellen einen wichtigen Schritt in Richtung einer breiten Implementierung von aktiven Graphen-Sensor-Arrays für die neurowissenschaftliche Forschung dar. Sie bieten eine stabile und biokompatible Sensortechnologie für die langfristige Kartierung epikortikaler Hirnaktivität mit breitem Frequenzband während spontanem Verhalten.

Methoden

Herstellung von g-SGFET-Arrays

Arrays aus g-SGFETs und biokompatiblen Bauelementen wurden auf einem 10 μm dicken Polyimidfilm (PI-2611, HD MicroSystems) hergestellt, der durch Schleudern auf einen 4-Zoll-Si/SiO2-Wafer aufgebracht und bei 350 °C gebacken wurde. Polyimid wurde aufgrund seiner thermischen Oxidationsstabilität, seiner hohen mechanischen Festigkeit, seiner isolierenden Eigenschaften und seiner chemischen Beständigkeit sowie seiner erwarteten Biokompatibilität und der bereits berichteten Stabilität für chronische Implantate als Substrat gewählt. Eine erste Metallschicht (10 nm Ti/100 nm Au) wurde mittels Elektronenstrahlbedampfung auf einem zuvor photodefiniert-negativen AZ 5412E (Clariant, Deutschland) abgeschieden und anschließend durch einen Lift-off-Prozess strukturiert. Anschließend wurde das durch chemische Gasphasenabscheidung auf Cu gewachsene Graphen übertragen (Prozess von Graphenea s.a.). Bei den Platingeräten für Biokompatibilitätsstudien folgte auf die erste Stufe eine weitere Photolithographie, Metallbedampfung und Lift-off. Das Graphen wurde dann durch Sauerstoffplasma (50 sccm, 300 W für 1 min) in einem reaktiven Ionenätzverfahren (RIE) strukturiert. Als photodefinierbarer Resist zum Schutz des Graphens im Kanalbereich wurde HIPR 6512 verwendet, um die Kontamination zu minimieren. Nach dem Ätzen des Graphens wurde eine zweite Metallschicht auf den Kontakten nach dem gleichen Verfahren wie für die erste Schicht strukturiert. Auf den Lift-off-Schritt folgte ein Ausglühen im Ultrahochvakuum, um den Kontaktwiderstand zu verbessern und Resistrückstände aus dem Graphenkanal zu entfernen. Anschließend wurden die Transistoren mit einem 3 µm dicken fotodefinierbaren SU-8-Epoxid-Fotoresist (SU-8 2005 Microchem) isoliert, wobei der aktive Bereich des Transistorkanals unbedeckt blieb. Der SU-8-Fotoresist wurde als Isoliermaterial gewählt, weil er fotodefinierbar ist und weil über seine Verwendung in chronischen Implantaten bereits berichtet wurde. Die Verwendung eines photodefinierbaren Passivierungspolymers ist bei der derzeitigen Graphen-Technologie erforderlich, da das Ätzen der Passivierungsschicht auch den darunter liegenden Graphenkanal angreifen würde. Das Polyimid-Substrat wurde in einem reaktiven Ionenätzverfahren strukturiert, wobei eine dicke AZ9260-positive Photoresist-Schicht (Clariant) als Ätzmaske verwendet wurde. Die neuronalen Sonden wurden dann vom Wafer abgezogen und in einen Null-Steckverbinder gesteckt, um sie mit unseren kundenspezifischen elektronischen Instrumenten zu koppeln. Schließlich wurden die Geräte in Ethanol gespült, um verbleibende Resistrückstände auf dem Graphenkanal zu entfernen.

Bewertung der Phasen-Amplituden-Kopplung

Die zwischen den Kanälen im Infraschall-Frequenzband (0,005-0,05 Hz) beobachtete Signalinversion wurde quantitativ bewertet, indem die Wahrscheinlichkeitsdichte einer Signalamplitude in Abhängigkeit von ihrer Phase in Bezug auf ein zweites Signal berechnet wurde. Um die Phase zwischen den beiden Signalen abzuschätzen, wurde die Hilbert-Transformation jedes Signals mit der Python-Bibliothek scipy berechnet und die Differenz zwischen ihren Phasen ermittelt. Ein zweidimensionales Histogramm wurde dann verwendet, um die Wahrscheinlichkeitsdichte der Signalamplitude im Amplituden-Phasen-Raum auszudrücken (Abb. 3c).

Ethische Genehmigung und Umgang mit Tieren

Die In-vivo-Experimente standen im Einklang mit den Richtlinien der Europäischen Union zum Schutz von Wirbeltieren bei Versuchen (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010). Elektrophysiologische Experimente mit Long Evans Ratten wurden nach dem deutschen Tierschutzgesetz (TierSchG) durchgeführt und von den örtlichen Behörden genehmigt (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-170). Die experimentellen Verfahren mit Sprague-Dawley-Ratten zur Bewertung der Biokompatibilität wurden gemäß dem britischen Tierschutzgesetz (Animals (Scientific Procedures) Act, 1986) durchgeführt und vom Innenministerium und der lokalen Ethical Review Group der Universität Manchester genehmigt. Die Ratten wurden unter Standardbedingungen gehalten (Raumtemperatur 22 ± 2 °C, 12:12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus, Einschalten des Lichts um 10:00 Uhr), wobei Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung standen.

Implantation der Graphen-Sensor-Arrays für elektrophysiologische Messungen

Wie bereits in Garcia-Cortadella et. al.34 beschrieben, wurde eine erwachsene Long-Evans-Ratte mit einem Gewicht von 580 g mit MMF (Midazolam 2 mg/kg, Medetomidin 0,15 mg/kg, Fentanyl 0,005 mg/kg) anästhesiert. 1 Stunde nach der MMF-Induktion wurde Isofluran mit 1 % zugesetzt, um die Ratte betäubt zu halten, und Metamizol mit 110 mg/kg verabreicht. Der hintere-dorsale Bereich des Kopfes wurde rasiert, die Haut lokal mit Povidon-Jod desinfiziert und subkutan mit dem Lokalanästhetikum Bupivacain infiltriert. Anschließend wurde die Haut eingeschnitten und der dorsale Schädel durch stumpfe Dissektion sorgfältig gereinigt. Der getrocknete Schädel wurde mit dem UV-härtenden Klebstoff Optibond (Kerr) abgedeckt und ein 3D-gedruckter Basisring wurde mit Schrauben und Metabond-Zement (Parkell) am Schädel verankert.

Es wurden beidseitig symmetrische Kraniotomien mit einer maximalen Breite von 5 mm durchgeführt, die zwischen +2 mm und -8 mm in Bezug auf Bregma in der anterior-posterioren Achse lagen. Innerhalb dieser Kraniotomien wurde die Dura mater inzidiert und entfernt. Eine weitere Kraniotomie von 1 × 1 mm wurde über dem Kleinhirn durchgeführt. Alle Kraniotomien wurden mit vorpolymerisiertem Polydimethylsiloxan (PDMS) (Sylgard 184, Dow Corning, USA) im Mischungsverhältnis 1:10 abgedeckt und mit Vetbond (Animal Care Products, USA) versiegelt. Die Hautränder um das Implantat wurden vernäht und das Implantat mit einer Schutzkappe verschlossen.

Nach einer Woche Erholungszeit wurde das g-SGFET-Array unter Isofluran-Anästhesie (5% Induktion 1% Erhaltung) implantiert. Nach teilweiser Öffnung und seitlichem Aufklappen des die rechte Hemisphäre bedeckenden Polymers wurde das Array auf der Pialfläche so positioniert, dass es den hinteren Aspekt der rechten Hemisphäre bedeckte (ca. -7 bis -2 mm vom Bregma). Darüber hinaus wurden zwei Pt-Ir-Drähte auf beiden Seiten des g-SGFET-Arrays implantiert. Einer proximal zum Array, der andere distal auf der gegenüberliegenden Hemisphäre. Die Polymerabdeckung wurde in ihre Position zurückgeklappt, wobei das flexible Kabel des g-SGFET-Arrays durch den verbleibenden Schlitz austrat. Eine zweite PDMS-Abdeckung wurde verwendet, um sowohl das eingeschnittene Polymer als auch das Array abzudecken, mit Vetbond und Evoflow (Ivoclar Vivadent, Liechtenstein) am Schädel verankert und mit Silikongel 3-4680 (Dow Corning, USA) versiegelt. Schließlich wurde eine Ag/AgCl-Elektrode in Kontakt mit dem Kleinhirn als Referenz für die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität platziert.

Implantation der Graphen-, Platin- und PI-Vorrichtungen zur Bewertung der Biokompatibilität

Sprague-Dawley-Ratten (200-280 g) wurden mit Isofluran-Inhalation (typischerweise 3,5 % zur Einleitung und zwischen 1,5 und 2,5 % zur Aufrechterhaltung) in 100 % Sauerstoff betäubt. Der Kopf des Tieres wurde rasiert, und das Tier wurde in einem stereotaktischen Rahmen mit Zahn- und Ohrstangenfixierung positioniert. Die Tiere wurden auf eine Wärmedecke gelegt, ein Pulsoximeter wurde an den Füßen befestigt und eine Rektalsonde zur Überwachung der Körpertemperatur eingeführt. Viscotears Flüssiggel (Bausch & Lomb, UK) wurde zum Schutz der Augen während des Eingriffs aufgetragen. Die Narkosetiefe wurde während des gesamten Eingriffs durch das Ausbleiben des Fußreflexes bestätigt und aufrechterhalten. Alle Versuchstiere erhielten eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,03 mg/kg). Der Kopf wurde mit Jod abgetupft und ein großer Hautlappen entfernt, um den Schädel, nicht aber den Schläfenmuskel freizulegen. Das Periost wurde mit einem Knochenspachtel entfernt. Die Haut um den Umfang des entfernten Gewebes wurde mit Vetbond Gewebekleber (3 M, UK) auf den Knochen geklebt. Eine Kraniotomie (~4 mm x 6 mm) wurde mit einem chirurgischen Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer durchgeführt. Lambda wurde als posteriore Referenz für die Kraniotomie verwendet, die mindestens 1 mm lateral der Mittellinie positioniert wurde, um den Sinus sagittalis zu vermeiden. Die Bohrstelle wurde regelmäßig mit Kochsalzlösung gespült, um Hitzeschäden zu vermeiden. Sobald der Knochen am Rande der Kraniotomie ausreichend dünn war, wurden alle Knochenspäne und andere Ablagerungen mit Druckluft entfernt und der Knochenlappen vorsichtig abgehoben. Die Kortikalisoberfläche wurde mit Ringerlösung feucht gehalten. Mit einer feinen Nadel, deren Spitze in einem 90°-Winkel gebogen war, wurde die Dura vorsichtig von der Kortikalisoberfläche abgehoben, und mit einer weiteren Nadel wurde ein Schlitz in die Dura eingebracht, wobei die Blutgefäße sorgfältig zu umgehen waren. Durch Anheben der Dura neben der Öffnung mit einer feinen Pinzette wurde eine Tasche geschaffen, und das Gerät wurde vorsichtig auf der Kortikalisoberfläche platziert. Die Dura wurde dann neu positioniert, um das Gerät an seinem Platz zu halten. Ein Glasfenster (UQG Optics, UK) in der entsprechenden Größe wurde so positioniert, dass es die Kraniotomie ausfüllte, und mit Zahnzement (Superbond C&B, Prestige Dental) befestigt. Die Tiere erhielten eine subkutane Injektion von 0,9 %iger Kochsalzlösung (1 ml) und wurden in einem Erholungskäfig untergebracht, bis die Betäubung abgeklungen war.

Verhaltenstests zur Bewertung der Biokompatibilität

Bei allen Tieren wurden im Alter von 5 Wochen vor der Operation Grunddaten zum Verhalten erhoben. Eine Woche später wurden alle Tiere einer von fünf Gruppen zugeteilt: Graphenelektrode, Platinelektrode, blanke Elektrode, Scheinoperation (keine Elektrode implantiert) oder naiv (keine Operation). Die Tiere wurden dann zu einem oder zwei Zeitpunkten getestet – 2 Wochen, 2 und 6 Wochen oder 6 und 12 Wochen nach der Operation. Die Zeitpunkte wurden in Übereinstimmung mit den ISO 10993-Definitionen gewählt, wobei eine verlängerte Exposition als >24 Stunden, aber <30 Tage, und eine dauerhafte Exposition als >30 Tage definiert ist (ISO 10993-6:2007).

Vor der ersten Exposition gegenüber NOR wurden die Ratten am Tag vor dem Test zur Akklimatisierung für 20 Minuten mit ihren Käfiggenossen in die leeren Arenen gesetzt. Die quadratischen Plexiglasboxen (mit einer Grundfläche von 52 cm mal 52 cm und einer Höhe von 30 cm) hatten einen weißen Boden und schwarze Wände. Die Tiere wurden vor Beginn der Experimente an die NOR-Arena akklimatisiert, indem sie für 3 Minuten in die Arena gesetzt wurden, während sich dort keine Objekte befanden. Der NOR-Test besteht aus einem Trainings- und einem Testversuch, die durch einen Zeitraum zwischen den Versuchen getrennt sind. In der Trainingssitzung wurden zwei identische Objekte in der Arena platziert, z. B. zwei Flaschen von gleicher Form und Größe. In der Testphase wurden zwei neue Objekte in der Arena platziert, ein Objekt, das mit dem der Trainingssitzung identisch war, und ein völlig neues Objekt, z. B. eine Dose. Für die Trainingssitzungen wurden die Tiere in die Arena gesetzt und durften sie 3 Minuten lang erkunden, bevor sie in den Heimkäfig zurückkehrten. Die Tiere wurden 30 Minuten lang im Heimkäfig gelassen, bevor sie für die Testsitzung in die Arena gesetzt wurden, wo sie wiederum 3 Minuten lang frei erkunden konnten. Die Zeit, die das Tier mit den Objekten interagierte, wurde sowohl bei den Trainings- als auch bei den Testversuchen gemessen. Bei einem gesunden Tier sollte das Tier während der Testsitzung mehr Zeit mit dem neuen Objekt verbringen. Idealerweise sollten diese Tests bei keinem Tier mehr als drei Mal durchgeführt werden. Daher wurden die Tiere in der 12-Wochen-Implantationsgruppe zu Beginn und dann 6 und 12 Wochen nach der Implantation auf NOR getestet. Alle anderen Tiere wurden zu jedem ausgewählten Zeitpunkt vor der Tötung getestet.

Die Videos der NOR-Testversuche wurden von verblindeten Forschern manuell mit einer Online-Stoppuhr (http://jackrrivers.com/program/) ausgewertet. Die Tiere wurden als mit einem Objekt interagierend eingestuft, wenn ihre Nase oder ihre Pfoten das Objekt berührten. Die Zeit, die für die Interaktion mit den beiden Objekten aufgewendet wurde, wurde analysiert, und ein Diskriminationsverhältnis wurde ermittelt, indem die Zeit, die für die Interaktion mit dem neuen Objekt aufgewendet wurde, durch die Zeit, die für die Interaktion mit dem bekannten Objekt aufgewendet wurde, geteilt wurde. Ein Unterscheidungsverhältnis von >0,5 deutet darauf hin, dass ein Tier das neue Objekt bevorzugt, was ein Zeichen für normale Kognition ist.

Entnahme und Verarbeitung des Gewebes

2 Wochen, 6 Wochen oder 12 Wochen nach der Implantation der Geräte wurden die Tiere mit einer für die Art der nachfolgenden Analyse geeigneten Methode gekeult. Für die histologische Untersuchung wurden die Tiere einer Perfusionsfixierung mit heparinisierter Kochsalzlösung unterzogen, gefolgt von 4% Paraformaldehyd (PFA; Sigma-Aldrich, UK; 441244) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Sigma-Aldrich, UK; D8537). Das Gewebe wurde mindestens 24 Stunden in PFA gelagert, dann für 48 Stunden in eine Saccharoselösung überführt und eingefroren, bevor 40 Schnitte von 25 µm pro Tier kryogenisiert wurden. Die Kryoschnitte wurden auf einen von drei Markern angefärbt: (i) ionisiertes kalziumbindendes Adaptormolekül 1 (Iba1) zur Quantifizierung der Mikroglia-Population, (ii) terminale Deoxynukleotidyltransferase dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL) zur Bewertung der Apoptose oder (iii) Hämotixylin und Eosin (H&E) zur Bewertung der groben Morphologie des Hirngewebes. Die Gewebeschnitte wurden in 5%igem Ziegenserum in PBS mit 0,1% Triton-X blockiert, bevor sie über Nacht mit dem primären Iba1-Antikörper (1:200, 019-19741, Wako) inkubiert wurden. Zur Visualisierung wurde ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-594-Sekundärantikörper (1:1000, A11012, Invitrogen) verwendet. Bei immunfluoreszierend gefärbtem Gewebe wurde eine DAPI-Gegenfärbung durchgeführt, bevor die Objektträger mit ProLong Gold Mountant (P10144, ThermoFisher) aufgezogen wurden.

Für die TUNEL-Färbung wurden die Anweisungen des Herstellers befolgt und ein DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System (G7360, Promega) verwendet. Nach der Visualisierung der TUNEL-Färbung mit Diaminobenzidin (DAB) wurden die Objektträger mit Methylgrün (0,1 % w/v wässrige Lösung, Alfa Aesar) gegengefärbt. Die H&E-Färbung erfolgte standardmäßig mit einer 1-minütigen Hämotoxylin-Färbung, gefolgt von einer Essigsäure-Spülung und einer 30-s-Eosin-Färbung. Die Objektträger wurden sowohl für die TUNEL- als auch für die H&E-Färbung mit DPX-Montiermittel (06522, Sigma-Aldrich) aufgezogen. Die Objektträger wurden mit dem 3D Histec Pannoramic250-Objektträgerscanner abgebildet und die Bilder mit CaseViewer (Version 2.2, 3DHistech Ltd) analysiert. Die TUNEL-positiven Zellen wurden gezählt und über die kortikale Oberfläche in vierzig 25-µm-Schnitten pro Hemisphäre gemittelt. Mikrogliazellen wurden individuell in eine von vier Morphologien eingeteilt: Grad 0 (ruhend/ramifiziert), Grad 1 (entramifizierend/re-ramifizierend), Grad 2 (aktiviert/ameboid) oder Grad 3 (geclustert & aktiviert), wie zuvor beschrieben88. Die Aktivierung wurde als Prozentsatz der gesamten Mikrogliazellen bestimmt, die entweder Grad 3 oder 4 waren.

Für den ELISA wurden die Tiere durch Erhöhung der CO2-Konzentration gekeult, bevor eine Herzpunktion zur Blutentnahme durchgeführt wurde. Das Hirngewebe wurde entnommen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Das extrahierte Blut wurde in einem Blutentnahmeröhrchen (Vacutainer, Becton Dickson, UK) aufgefangen und 15-30 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen gelassen. Das Röhrchen wurde bei 5000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert, und der resultierende Serumüberstand wurde aufgefangen und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Von der naiven Kontrollgruppe standen nicht genügend Serumproben zur Verfügung, so dass diese Gruppe von der Analyse ausgeschlossen wurde. Hirngewebe wurde durch Zugabe von flüssigem Stickstoff und Zerkleinern des Gewebes zu einem Pulver lysiert, dem NP-40-Lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tric-Cl, 1% Nonidet P40-Ersatz, Fluka, pH-Wert auf 7,4 eingestellt) mit Protease- und Phosphataseinhibitor (Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, ThermoFisher Scientific) zugesetzt wurde. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 5000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, und der Überstand wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Es wurden ELISA-Kits für vier Zytokine verwendet: IL-17a (437904, Biolegend), IFN-γ (439007, Biolegend), TNF-α (438204, Biolegend) und IL-6 (437107, Biolegend). Für alle vier Kits wurden die Herstelleranweisungen befolgt.

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Bewegungserfassung und Klassifizierung von Verhaltenszuständen

Die Ratte wurde bis zu 24 Stunden lang während ihres spontanen Verhaltens in einer 100 × 100 cm großen Aufzeichnungsarena aufgezeichnet, an die sie zuvor gewöhnt wurde. Während der Aufzeichnungssitzung hatte sie ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Die Batterie des drahtlosen Systems wurde alle 6 Stunden ausgetauscht. Ein Bewegungserfassungssystem (Mocap) (Optitrack) mit passiven reflektierenden Markern und 8 Kameras wurde verwendet, um die Bewegung des Tierkopfes im dreidimensionalen Raum zu verfolgen. Vier reflektierende Marker wurden an der Schutzkappe verankert und ihre Position wurde gemittelt, um die Position in 3D und die Ausrichtung des Kopfes zu ermitteln. Die momentane Kopfgeschwindigkeit in 3D wurde als zeitliche Ableitung des Moduls der Raumkoordinaten berechnet. Für die Analyse der Mocap-Daten wurde die Software Motive 2.2 verwendet.

Für die Klassifizierung des Verhaltens als aktiv oder inaktiv wurden Perioden, in denen die Kopfgeschwindigkeit 100 mm/s überstieg, als aktiv gekennzeichnet. In einem zweiten Schritt wurden aktive Perioden, die kürzer als 5 Sekunden waren, übersprungen, während Lücken in aktiven Perioden, die kürzer als 5 Sekunden waren, mit dem benachbarten aktiven Zustand verkettet wurden. Zeitpunkte, die nicht unter diese Definition von aktiv fielen, wurden als inaktiv gekennzeichnet. Das Verhältnis zwischen aktiven und inaktiven Perioden variierte erheblich über den gesamten Aufzeichnungszeitraum (zwischen 6,6 % und 88,0 % aktiv pro Stunde, Mittelwert 40,2 % ± 4,7 % aktiv pro Stunde).

Hintere Ereignisse wurden als kurze Erhebungen des Kopfes auf Höhen definiert, die das Tier dazu zwingen, sich auf die Hinterbeine zu stellen. Nach visueller Inspektion der z-Höhen während der gesamten Aufzeichnungen wurde ein Schwellenwert von 200 mm Höhe über dem Boden festgelegt, um punktuelle Aufstehvorgänge effektiv von anhaltenden Höhenschwankungen an niedrigeren z-Positionen zu trennen (siehe Zusatzinformation S10). Während aktive und inaktive Zustände als sich gegenseitig ausschließend definiert wurden, wurden Aufstehvorgänge als Substrat des aktiven motorischen Zustands betrachtet.

Verarbeitung und Analyse neuronaler Signale

Die drahtlose Kopfbühne wurde mit der Software Multi Channel Experimenter 2.12.1 gesteuert und die aufgezeichneten Daten wurden mit dem Multi Channel Data Manager 1.13.1 in das HDF5-Format konvertiert. Die neuronalen Daten wurden mit Hilfe von Python 2.7-Skripten entsprechend der Transkonduktanz der g-SGFETs kalibriert und zur Datenexploration in die Neuroscope-Software exportiert (siehe Erklärung zur Verfügbarkeit von Daten und Code). Die Analyse der neuronalen Signale erfolgte mithilfe von Matlab 2016b-Skripten (siehe Erklärung zur Verfügbarkeit des Codes).

Klassifizierung der Gehirnzustände

Zwei Kanäle des epikortikalen Arrays wurden für die Trennung der Hirnzustände ausgewählt. Ein Kanal wurde aus dem hinteren Bereich des Arrays ausgewählt, der vermutlich über der Hippocampus-Formation liegt und ausgeprägte Theta-Oszillationen aufweist. Ein zweiter Kanal wurde aus dem frontalen Bereich ausgewählt, um die Region und die Nachbarschaft des somatosensorischen Kortex aufzuzeichnen, wo Hochspannungsspindeln am stärksten ausgeprägt sind. Leistungsspektren wurden an geweißten LFP-Signalen im Bereich von 1 bis 200 Hz unter Verwendung von Multitaper-Methoden mit 4-s-Fenstern in gleitenden 0,5-s-Schritten berechnet. Zunächst wurden langsame Wellenzustände (SW) als Perioden identifiziert, in denen der z-Score der summierten Leistung der Delta- (1-4 Hz) und Alpha-Beta-Bereiche (10-25 Hz) -0,1 überstieg. Lücken, die kürzer als 5 s waren, wurden mit benachbarten Perioden verkettet.

SW-Zustände, die mit einem inaktiven motorischen Zustand zusammenfielen und einen zeitlichen Abstand von >10 s zum letzten vorangegangenen Hochspannungsspindel-Ereignis (HVS) aufwiesen, wurden als langsamer Wellenschlaf (SWS) definiert. In Anlehnung an frühere Literatur gingen wir von einer Unvereinbarkeit zwischen HVS und tiefem Langsamschlaf bei nicht betäubten Long-Evans-Ratten aus84. HVS haben eine ähnliche Frequenz wie Theta-Oszillationen, unterscheiden sich aber aufgrund ihrer stark nicht-sinusförmigen Wellenform deutlich in der Ausprägung mehrerer höherer Harmonischer. Aufgrund dieser Tatsache wurde die spektrale Leistung im Frequenzband von 20 bis 50 Hz auf dem HVS-Referenzkanal verwendet, um HVS-Episoden selektiv zu erkennen und sie von der Theta-Aktivität zu unterscheiden. Der Mittelwert der Multitaper-Leistungsspektren von 20 bis 50 Hz wurde berechnet und anschließend mit einem z-Score versehen. Perioden mit z-Score-Werten von mehr als 0,7 wurden als HVS bezeichnet. Kandidaten für HVS-Perioden, die kürzer als 1 s waren, wurden übersprungen, um falsch-positive Ergebnisse durch gelegentliche scharfe Einzelwellen-Transienten unbestimmter physiologischer Natur zu minimieren. Die Spektralprofile der einzelnen HVS-Ereignisse wurden post-hoc klassifiziert, um Artefaktkontaminationen zu entfernen. Beginn und Offset der Spitzenleistung, die momentane Frequenz und die Leistung der ersten spektralen Spitze wurden aus jedem Ereignis extrahiert.

Theta-Zustände wurden auf der Grundlage des Verhältnisses zwischen der Leistung im Theta- (5-9,5 Hz) und Delta-Bereich (2-4 Hz) auf dem Theta-Referenzkanal definiert. Lücken, die kürzer als 10 s waren, wurden mit benachbarten Theta-Perioden verkettet. Theta, das mit einem inaktiven motorischen Zustand zusammenfiel, wurde als inaktives Theta bezeichnet. Alle inaktiven Theta-Perioden, denen ein SW-Zustand innerhalb von 1 s vorausging und die länger als 5 Sekunden waren, wurden als REM-Schlaf betrachtet. Alle übrigen Theta-Perioden wurden als Wach-Theta bezeichnet. Schließlich wurden alle Perioden, die weder SWS noch REM noch waches Theta waren, als waches Nontheta definiert. Es ist anzumerken, dass das Vorhandensein von Mikrozuständen mit niedriger Amplitude während des NREM-Schlafs bereits beschrieben wurde89. Es bleibt zu klären, inwieweit eine Untergruppe von Perioden mit niedriger Amplitude im SW-Bereich, die in dieser Studie dem Wach-Nontheta zugeordnet wurde, auf Zustände zutrifft, die von Miyawaki und Kollegen als Mikrozustände mit niedriger Aktivität im Schlaf definiert wurden89.

Alle Zustände wurden als sich gegenseitig ausschließend betrachtet, mit Ausnahme von HVS, das als ein Ereignis betrachtet wurde, das während eines laufenden Hintergrundzustands auftritt, diesen aber nicht unterbricht. Daher wurden für jede HVS-Episode die unmittelbar vorangehenden und nachfolgenden Gehirnzustände zusammengeführt, wenn sie zum selben Zustand gehörten. Die gesamte Spektralanalyse wurde mit einer eigens entwickelten Matlab-Implementierung der Multitaper-Schätzung90 durchgeführt. Die Analyse der g-SGFET-Leistung wurde in Python durchgeführt. Die Analyse der ISA-Gehirndynamik beschränkte sich auf Immobilität und REM-Schlaf, bei denen der potenzielle Einfluss von Bewegungsartefakten auf die langsamen Fluktuationen ausgeschlossen werden konnte.

 


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Statistische Analyse

Zur Bewertung der Ausbeute und Homogenität der g-SGFETs wurden 9 neuronale Sonden mit jeweils 64 g-SGFETs in vitro charakterisiert. Diese Daten sind in den Boxplots in Abb. 2 dargestellt. Die Boxen erstrecken sich vom unteren bis zum oberen Quartil, mit einer Linie beim Median. Die Whisker erstrecken sich über das 1,5-fache des Interquartilsbereichs, und die Datenpunkte außerhalb der Whisker sind durch einen Punkt gekennzeichnet. Die longitudinale Bewertung der Stabilität von g-SGFETs in vivo wurde mit einem 64-Kanal-Array durchgeführt, das in den Kortex einer Ratte implantiert wurde. Die in Abb. 3 gezeigten Boxplots sind wie in Abb. 2 definiert. In den Feldern a und e von Abb. 3 sind die statistische Stichprobe alle 8 g-SGFET, die mit den DC-gekoppelten Kanälen der Kopfbühne verbunden sind. Die Felder d und f von Abb. 3 entsprechen allen 64 g-SGFETs auf dem Array. Feld g schließlich zeigt die normalisierte Reaktion der 10 g-SGFETs an den Positionen mit dem höchsten induzierten elektrischen Feld während der bipolaren Stimulation.

Zur Bewertung der Biokompatibilität wurden drei Gerätetypen hergestellt: Platin, Graphen und Polyimid (blank). Den Ratten in jeder dieser Gruppen wurde einer der drei Gerätetypen in den parietalen Kortex des Gehirns implantiert. Eine vierte Gruppe von Tieren wurde vollständig operiert, ohne dass ein Gerät implantiert wurde (Scheinkontrolle), und eine fünfte Gruppe (naiv) wurde nicht operiert. Für die NOR-Tests wurden für alle Gruppen zu allen Zeitpunkten n = 7 Ratten verwendet, mit Ausnahme von 12 Wochen, für die je nach Gruppe n = 3-7 Tiere verwendet wurden. Für den Zytokinnachweis im Hirngewebe wurden 2 und 6 Wochen lang n = 4 Ratten und 12 Wochen nach der Implantation n = 3 Ratten verwendet. Für die Mikroglia-Aktivierung betrug die Anzahl der Ratten n = 3 nach 2 und 12 Wochen und n = 2 nach 6 Wochen (oder 3 für die kontralaterale Hemisphäre). In allen Fällen wurde auch die kontralaterale Hemisphäre als Kontrolle ausgewertet. Daten mit n = 3 oder mehr wurden mit einer Zwei-Wege-ANOVA analysiert, um alle Zeitpunkte und Interventionen zu vergleichen. Anschließend wurden zu jedem Zeitpunkt multiple Vergleiche nach Dunnett durchgeführt, um jeden chirurgischen Eingriff mit der Kontrolle zu vergleichen. *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 sind für jeden chirurgischen Eingriff in Abb. 4 angegeben.

Die Messung der Modulation der Gamma-Aktivität während der Aufzucht wurde für 163 Aufzuchtsereignisse ausgewertet, die im Verlauf einer 24-stündigen Aufzeichnung bei einer Ratte gemessen wurden. Während der gleichen 24-stündigen Aufzeichnung wurden auch die HVS gemessen. Fünfhundertsechsundsechzig Ereignisse wurden während der Unbeweglichkeit und 92 Ereignisse während des REM-Schlafs festgestellt. Die Unterschiede im Spektralgehalt der HVS während der verschiedenen Zustände (IMM und REM) wurden mit einem Wilcoxon-Rangsummen-Test bewertet (die p-Werte sind im Haupttext angegeben). Die gezeigten elektrophysiologischen Daten beziehen sich auf eine Ratte. Die große statistische Stichprobe von Ereignissen ermöglicht die Veranschaulichung der Fähigkeiten der Graphen-basierten Technologie, jedoch sollte die Interpretation dieser Ergebnisse der Variabilität zwischen den Messungen und Tieren unterliegen.

Die Modulation der ISA-Leistung durch den REM-Zustand im Vergleich zum SWS-Zustand wurde auf zwei Arten bewertet: erstens für den Zeitraum direkt um den Zustandsübergang (-30 bis 30 Sekunden um den REM-Einstieg). Zweitens wurde die ISA-Leistung in beiden Zuständen über ihre gesamte Dauer ausgewertet, nicht nur beim Übergang von SWS zu REM. Der Vergleich der ISA-Leistung zwischen REM- und SWS-Zuständen beschränkte sich auf die 44 REM-Episoden, die länger als 40 s dauerten (siehe ergänzende Informationen S12B). Um auf frequenzspezifische Veränderungen während des Zustandsübergangs zu testen, verglichen wir die Verteilungen der medianen spektralen Leistung über die Versuche für die 30 Sekunden vor und nach dem SWS-REM-Übergang für jedes Frequenzband. Die Signifikanz wurde mittels Permutationstest für jedes Frequenzband ermittelt (n = 1000 Permutationen, siehe Abb. 5d Beispielkanal und ergänzende Informationen S12C für alle DC-Arbeitskanäle). Die Zunahme der ISA und die gleichzeitige Abnahme der 1-4 Hz-Leistung während des SWS-REM-Übergangs ist nach dem Permutationstest (n = 1000 Permutationen) auf allen DC-Kanälen signifikant, mit Ausnahme eines ausgeschlossenen Kanals, wie bei der Längsschnittauswertung in Abb. 3a, e, aufgrund eines schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses (Supplementary Information S12C). Zweitens testeten wir auf statistische Unterschiede zwischen den Verteilungen der integrierten Leistung im ISA-Band (0,01-0,1 Hz) in SWS- und REM-Zuständen mit dem Wilcoxon-Rangsummentest (siehe Abb. 5e, Testergebnisse für jeden Kanal in den ergänzenden Informationen S12D).

Die Modulation der LFP-Leistung durch die vom Gleichstromsignal abgeleitete ISA- und LFP-Phase wurde anhand der momentanen schnellen Frequenzleistung, gewichtet mit der resultierenden Länge der momentanen langsamen Frequenzphasenvektoren, normalisiert durch die mittlere LFP-Leistung im jeweiligen Band72 , quantifiziert, wobei die Größe die Stärke der LFP-Leistungsmodulation zu einer bevorzugten Phase der ISA oder LFP widerspiegelt. ISA- und LFP-Phase und LFP-Leistung wurden als Winkel und Absolutwert des analytischen Signals der jeweiligen AC- und DC-Kanalsignale berechnet, die mit 0,04 bzw. 0,4 Hz Bandbreite bandgefiltert wurden. Die Signifikanz der Modulation wurde anhand von 1000 Surrogat-Phasen-Leistungspaaren getestet, die zufällig um bis zu 100 s gegeneinander verschoben waren. Der sich daraus ergebende empirische p-Wert wurde nach einem Verfahren zur Kontrolle der Falschentdeckungsrate mit einer Fehlerrate von 0,001 korrigiert. Für die Erstellung topographischer Karten der Theta- und Spindelleistungsbandmodulation verwendeten wir die mittlere Modulationsstärke für das LFP-Leistungsband von 8-9 Hz (Theta) und 10-14 Hz (Spindelband) sowie die ISA-Phasenfrequenz von 0,05-0,1 Hz, die für jeden AC-Kanal (LFP-Leistung) und einen fronto-medialen DC-Kanal (ISA-Phase) berechnet wurde.

Quelle: https://www.nature.com/articles/s41467-020-20546-w

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